羥基紅花黃色素A和黃芪多糖單用及合用抗腎間質(zhì)纖維化作用及機(jī)制.pdf

1、目前，隨著生活水平和醫(yī)療水平的提高，人們對(duì)于醫(yī)療健康有了更高的期盼。然而，慢性腎臟疾病（Chronic kidney disease, CKD）在全球范圍內(nèi)仍然呈遞增趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康、加重家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。越來越多的研究表明，腎間質(zhì)纖維化（Renal Interstitial Fibrosis, RIF）是各種慢性腎臟疾病發(fā)展成終末期腎?。‥nd Stage Renal Disease, ESRD）的共同通路和病理學(xué)基礎(chǔ)，其損傷

2、程度和范圍也是反應(yīng)腎臟功能和腎臟疾病預(yù)后的可靠指標(biāo)。因此，延緩或抑制RIF成為治療CKD的主要目標(biāo)。由于腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今尚無定論，腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、腎細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等因素認(rèn)可度廣泛。其中EMT和細(xì)胞凋亡在促使RIF發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，成為目前的研究熱點(diǎn)。
　　對(duì)于RIF的治療，目前主要有西藥治療、基因治療和

3、中藥治療。其中中藥治療在我國已有千百年的歷史，在中醫(yī)辨證論治、標(biāo)本兼治的理念下運(yùn)用補(bǔ)氣活血化瘀治則取得了良好防治效果。黃芪和紅花分別是補(bǔ)氣和活血的代表性藥物，在古典中藥方劑以及現(xiàn)代常用的中成藥中絕大部分含有這一藥對(duì)。本人所在的課題組從事活血化瘀藥物研究多年，尤其是在前兩個(gè)國科金（NO.30672662； NO.81173514）的資助下運(yùn)用首創(chuàng)的“差示血清色譜法”對(duì)紅花的研究，結(jié)果表明羥基紅花黃色素A是紅花中主要活性成分并發(fā)揮主要藥效。

4、黃芪多糖是黃芪中含量較高的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有延緩RIF的作用。然而兩藥單用或者合用治療RIF的作用機(jī)制尚不明晰。本課題在在研國科金（NO.81373947）的資助下，擬通過體內(nèi)構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）大鼠模型和體外以TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞EMT模型，著重從抗腎組織細(xì)胞凋亡和抗纖維化方面探究紅花和黃芪的主要有效成分羥基紅花黃色素A（Hydro

5、xysaffloryellow A， HSYA）和黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）單用及配伍對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用及其機(jī)制。
　　第一部分 HSYA和APS單用及合用對(duì)UUO模型大鼠的藥效學(xué)研究
　　目的：研究HSYA和APS單用及合用對(duì) UUO大鼠腎臟病變的影響，觀察HSYA和APS單用及合用對(duì)TGF-β1和p-smad3蛋白表達(dá)的影響。
　　方法：30只健康雄性SD大鼠（200

6、±20g）隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（sham）、UUO組、羥基紅花黃色素A治療組（HSYA）、黃芪多糖治療組（APS）、羥基紅花黃色素A和黃芪多糖合用治療組（H+A）。UUO模型組和各治療組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組同模型組操作，但只游離輸尿管不結(jié)扎。造模第2天開始給HSYA和APS灌胃治療，連續(xù)14天后處死，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清-80℃保存以備生化指標(biāo)檢測(cè)。將新鮮腎組織取出后，沿冠狀面剖開，一半用錫紙包裹-80℃保存，以備蛋白檢測(cè)

7、。另一半于4％多聚甲醛固定后進(jìn)行HE染色、Masson染色和免疫組化染色。
　　結(jié)果：給予UUO模型組大鼠HSYA、APS和H+A治療降低了異常升高的血肌酐（Serum creatinine， Scr）和尿素氮（serum ureanitrogen，BUN）水平；改善了病變腎組織的病理學(xué)變化；降低了腎組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和I-型膠原（collagen-I）的表達(dá)；下調(diào)了

8、高表達(dá)的TGF-β1和P-smad3蛋白。
　　結(jié)論： HSYA和APS單用及合用均能夠改善UUO導(dǎo)致的大鼠腎臟功能受損和病理學(xué)變化，減輕腎間質(zhì)纖維化損傷程度，并且兩藥合用治療效果比單用更為顯著。
　　第二部分 HSYA和APS單用及合用對(duì)腎組織上皮細(xì)胞凋亡的影響
　　目的： UUO模型造成的大鼠腎組織上皮細(xì)胞凋亡情況及探究HSYA和APS單用及合用對(duì)其改善情況。
　　方法：大鼠分組進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)和給藥同第

9、一部分，大鼠處死后取腎組織固定，腎組織中凋亡細(xì)胞情況通過TUNEL染色檢測(cè)技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)。Western Blot技術(shù)主要檢測(cè)腎組織中凋亡蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：與模型組相比，UUO大鼠經(jīng)HSYA和APS單用及合用治療后，可明顯觀察到凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡蛋白Bax和caspase-3表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增高，使Bax/Bcl-2比值降低。
　　結(jié)論：HS

10、YA和APS單用及合用延緩腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制可能與減少輸尿管結(jié)扎引起的腎細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　第三部分 HSYA和APS單用及合用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響
　　目的：研究HSYA和APS單用及合用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響；闡明HSYA和APS單用及合用通過調(diào)控TGF-β1/Smad3信號(hào)途徑阻礙EMT進(jìn)而延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的作用機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)HK-2

11、細(xì)胞，首先進(jìn)行將HSYA和APS進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，具體分組如：正常對(duì)照組（Control）、TGF-β1誘導(dǎo)組（TGF-β1）、不同濃度的HSYA（1、10、50、100、200μg/ml）治療組和不同濃度的APS（1、10、50、100、200μg/ml）治療組，分別作用于HK-2細(xì)胞12、24、48h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，選擇效果比較顯著的200μg/ml和48h作為最佳方案。將HK-2細(xì)胞分為正常對(duì)照組（Control）、TGF-β1刺

12、激組（TGF-β1）、HSYA（200μg/ml）處理組、APS（200μg/ml）處理組、H+A（1:1）處理組，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)前預(yù)先將細(xì)胞固定處理后進(jìn)行，Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在蛋白提取后方可進(jìn)行。
　　結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予HSYA和APS作用于細(xì)胞后細(xì)胞活力沒有明顯變化；給予HSYA和APS處理48h能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的異常增殖；免疫熒光結(jié)果顯示， a-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、一型膠原（colla

13、gen-I）和纖維連接蛋白（Fibronectin, FN）的表達(dá)在TGF-β1造模組明顯比正常HK-2增多，給予HSYA、APS和H+A處理后，三者的表達(dá)均相應(yīng)減弱；western blot檢測(cè)顯示，TGF-β1和其下游蛋白分子Smad3在TGF-β1處理后表達(dá)明顯增高于HSYA、APS和H+A治療組；而負(fù)調(diào)節(jié)蛋白Smad7在TGF-β1組的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，經(jīng)HSYA、APS和H+A處理后表達(dá)增加；經(jīng)蛋白印跡檢測(cè)的EMT標(biāo)志性