羥基紅花黃色素A抗興奮毒性神經(jīng)元死亡的神經(jīng)保護作用.pdf

1、目的：
　　 1.探討谷氨酸(Glu)興奮毒性損傷后，羥基紅花黃色素A(HSYA)對器官型腦片海馬齒狀回(HDG)神經(jīng)發(fā)生的影響。
　　 2.研究Glu興奮毒性損傷后，HSYA對器官型海馬腦片神經(jīng)細胞死亡的影響，以及保護線粒體功能的機制。
　　 3.探討Glu興奮毒性損傷后，HSYA對大鼠皮層神經(jīng)細胞凋亡的影響，以及對p38MAPK途徑誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 方法：
　　 1.制備出生后6天SD乳

2、鼠器官型海馬腦片，按隨機數(shù)字表法分為4組（每組6張腦片）:(1)生理鹽水對照組(3.5mMGlu+1ml生理鹽水干預(yù)，CG);(2)空白對照組(正常培養(yǎng)，不造模+不干預(yù)，Nor);(3)大劑量HSYA組(3.5mMGlu+1ml0.072mg/mlHSYA干預(yù)，HG1);(4)小劑量HSYA組(3.5mMGlu+1ml0.036mg/mlHSYA干預(yù)，HG2)。建立Glu損傷模型，造模前及造模后1d、3d和6d通過倒置顯微鏡及免疫熒光染

3、色觀察腦片生長情況，按常規(guī)方法分別進行BrdU與Nestin免疫熒光雙標染色。計數(shù)HDG中神經(jīng)干細胞(Neuralstemcells，NSCs)并進行重復(fù)測量的方差分析，每個時間點各組之間的比較采用單因素方差分析，各組內(nèi)不同時間之間的比較采用重復(fù)測量的方差分析，主效應(yīng)不同水平間的多重比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.制備出生后6天SD乳鼠器官型海馬腦片，按隨機數(shù)字表法分為5組（每組5張腦片）:(1)正

4、常對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，Nor）;(2)大劑量HSYA干預(yù)組（3.5mMGlu+1ml0.072mg/mlHSYA干預(yù)，HG1）;(3)小劑量HSYA干預(yù)組（3.5mMGlu+1ml0.036mg/mlHSYA干預(yù)，HG2）;(4)生理鹽水對照組(3.5mMGlu+1ml生理鹽水干預(yù)，CG);(5)大劑量HSYA對照組(1ml0.072mg/mlHSYA干預(yù)，Only)。建立Glu損傷模型，加入含有不同濃度HSYA的培養(yǎng)基(0.072

5、mg/ml，0.036mg/ml)孵化72小時，加入HSYA前、24和48小時后分別測量PI攝取量。蛋白免疫印跡分析5-LO，caspase-3，SOD2，P-Akt蛋白表達水平。各組之間PI熒光值，5-LO，caspase-3，SOD2，P-Akt蛋白表達量的比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，方差齊時組內(nèi)兩兩多重比較采用LSD法，方差不齊時組內(nèi)兩兩多重比較采用Tamhane'sT2法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

6、
　　 3.用胚胎18天(E18)SD大鼠制備前額葉皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，在體外培養(yǎng)10至14天后建立Glu損傷模型。按隨機數(shù)字表法將神經(jīng)細胞分為5組（每組5孔）:(1)正常對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，Nor）;(2)大劑量HSYA干預(yù)組（3.5mMGlu+0.072mg/mlHSYA干預(yù)，HG1）;(3)小劑量HSYA干預(yù)組（3.5mMGlu+0.036mg/mlHSYA干預(yù)，HG2）;(4)生理鹽水對照組(3.5mMGlu+生理

7、鹽水干預(yù)，CG);(5)大劑量HSYA對照組（0.072mg/mlHSYA干預(yù)，Only）。MTT法，Hoechst33258/PI雙染，流式細胞術(shù)(AnnexinV-FITC/PI雙染法)檢測神經(jīng)細胞死亡和凋亡。RT-PCR法檢測caspase-3、ATF2、p38MAPK、MAPKKK的表達。不同組別之間神經(jīng)細胞凋亡的比較、RT-PCR相對密度的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組內(nèi)兩兩多重比較采用LSD法，P＜0

8、.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.低倍鏡下(40×)正常腦片呈褐色，顏色均勻，透光性良好，可清晰分辨皮層、海馬（CA1-4及DG區(qū)）、腦室、皮層下核團，白質(zhì)纖維束等結(jié)構(gòu)。高倍鏡下(200×)可見胞質(zhì)和胞核。Glu損傷前后不同時間點之間NSCs(BrdU+，Nestin+)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=228.075，P＜0.001)，HG1，HG2，CG及Nor均如此，F(xiàn)值分別為31.537，181.762，

9、248.345和52.444，均P＜0.001。各組之間神經(jīng)干細胞數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=947.077，P＜0.001);從各時間點看，除Glu損傷前，各時間點神經(jīng)干細胞數(shù)均存在下列關(guān)系:Nor＞HG1＞HG2＞CG（均P＜0.001）。Glu損傷前后與不同組別之間存在交互效應(yīng)(F=123.639，P＜0.001)。
　　 2.3.5mMGlu損傷后24和48小時主要導(dǎo)致海馬DG區(qū)遞增性細胞死亡。Glu損傷24h后各組之間P

10、I熒光值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.305，P=0.002);HG1＜CG，HG1＜HG2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。Glu損傷48h后各組之間PI熒光值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.731，P=0.002);HG1＜CG，HG2＜CG，HG1＜HG2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組之間5-LO的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.702，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，差異有統(tǒng)

11、計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組之間caspase-3的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.419，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組之間SOD2的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.483，P=0.000);Nor＞HG1，Nor＞HG2，Nor＞CG，HG1＞CG，HG2＞CG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組之間P-Akt的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.299，P=0.00

12、0);Nor＞HG2，Nor＞CG，HG1＞CG,HG1＞HG2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　 3.MTT法測得各組之間細胞存活率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.063，P=0.000);Nor＜HG1，Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。Hoechst33258和PI雙染，HG1、HG2、CG三組呈弱藍色熒光細胞依次減少，呈強藍色及弱紅色雙染細胞依次增多，呈

13、強紅色及弱藍色的壞死細胞也依次增多。各組之間凋亡細胞率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.965,P=0.000);Nor＜HG1,Nor＜HG2,Nor＜CG,HG1＜CG,HG2＜CG,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。流式細胞分析:各組之間早期凋亡細胞率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=55.089，P=0.000);Nor＜HG1，Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG,HG2＜CG，HG1＜HG2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各

14、組之間晚期凋亡細胞率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.519，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG,HG1＜HG2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組之間壞死率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26.957,P=0.000);Nor＜HG1,Nor＜HG2,Nor＜CG,HG1＜CG,HG2＜CG,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果:各組之間caspase-3的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.237，P=0

15、.000);Nor＜HG2，Nor＜CG,HG1＜CG,HG2＜CG,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。各組之間ATF2的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.137，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。各組之間P38MAPK的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.645，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，HG1＜HG2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

16、(均P＜0.05)。各組之間MAPKKK的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.174，P=0.001);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG1＜HG2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.0.072mg/mlHSYA減輕Glu興奮毒性對NSCs的損傷，促進NSCs再生。
　　 2.0.072mg/mlHSYA減少Glu造成的神經(jīng)元死亡，這種保護作用24h出現(xiàn)，可持續(xù)至48h。Glu興

17、奮性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體功能障礙，0.072mg/mlHSYA通過降低5-LO和caspase-3，升高SOD2和磷酸化Akt的蛋白表達，保護線粒體功能，減少神經(jīng)細胞死亡。
　　 3.HSYA主要是通過抑制Glu誘導(dǎo)的細胞凋亡來保護神經(jīng)細胞。0.072mg/mlHSYA作用于p38MAPK通路的上游激活物MAPKKK，核心蛋白激酶p38MAPK，下游轉(zhuǎn)錄因子ATF2，以及最后的效應(yīng)蛋白caspase-3多個位點，下調(diào)其基因表達，