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文檔簡介
1、背景:
子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EM)是指子宮內(nèi)膜組織腺體和間質(zhì)在子宮以外的部位生長的雌激素依賴性婦科疾病。EM在生殖年齡婦女中的發(fā)病率為10~15%;不孕婦女中有20%~50%患有EM,而30%~50%的EM婦女患有生殖能力低下或者不孕。EM性不孕癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚無理想的治療方案,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,越來越受到醫(yī)學(xué)研究者們的關(guān)注。內(nèi)異方是導(dǎo)師俞超芹教授臨床治療EM性不孕癥的有效中藥復(fù)方,在多年
2、來的臨床實(shí)踐中取得了良好的療效,但其確切的作用機(jī)制目前尚不明確。
目的:
1、采用模擬經(jīng)期的內(nèi)膜組織,腹腔注射方式建立EM小鼠模型。
2、觀察EM模型小鼠的生殖能力,探討影響EM小鼠生殖能力的可能機(jī)制。
3、探討內(nèi)異方對(duì)EM模型小鼠生殖能力的影響,并從卵泡發(fā)育、盆腔微環(huán)境、盆腔粘連的角度探討內(nèi)異方的作用機(jī)制,為內(nèi)異方的臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
方法:
1、采用5只C57BL/6小
3、鼠和4只增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)轉(zhuǎn)基因小鼠作供體,20只C57BL/6小鼠作受體。模擬供體小鼠的月經(jīng)周期,將其經(jīng)期子宮內(nèi)膜組織剪碎后分別注射入受體小鼠的腹腔。普通模型組接受C57BL/6供體小鼠的子宮內(nèi)膜碎片,EGFP模型組接受EGFP供體小鼠的子宮內(nèi)膜碎片。3周后模型建立成功。通過小動(dòng)物活體成像、大體解剖、病理形態(tài)學(xué)觀察的方式,了解此造模方法的成模情況;將2組
4、模型小鼠內(nèi)異灶大小、數(shù)量和盆腔粘連評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,選擇最優(yōu)造模方式。
2、建立EM小鼠模型,設(shè)為模型組(n=21),并設(shè)立假手術(shù)組(n=21),空白組(n=15),共3組。通過陰道脫落細(xì)胞學(xué)方法對(duì)小鼠動(dòng)情周期進(jìn)行觀察,于動(dòng)情前期隨機(jī)處死模型組和假手術(shù)組各6只小鼠,取其卵巢組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察;于動(dòng)情間期對(duì)剩余3組小鼠行眶靜脈采血。將3組小鼠與性成熟雄鼠隨機(jī)2∶1比例合籠,進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn),合籠至出現(xiàn)陰栓,見栓記為妊娠第1天。
5、孕鼠于妊娠18天脫頸處死,處死后取腹腔沖洗液;模型組不孕小鼠行陰道涂片,于動(dòng)情間期采血,脫頸處死后取腹腔沖洗液。通過大體解剖法,觀察3組小鼠妊娠情況、胚胎情況,以及模型組小鼠內(nèi)異灶、盆腔粘連情況。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測動(dòng)情間期小鼠血清性激素(FSH、LH、E2、PRL)水平和糖類抗原125(carbohydrate antigen125,CA125)水
6、平,以及腹腔液中白介素-2(interleukin-2,IL-2)水平。通過動(dòng)情周期、交配實(shí)驗(yàn)、大體解剖、卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果,了解EM模型小鼠的生殖能力及盆腔微環(huán)境、盆腔粘連的狀況,探討其生殖能力下降的可能機(jī)制。
3、建立EM小鼠模型78只,按隨機(jī)數(shù)字法將其分為內(nèi)異方組(n=26)、孕三烯酮組(n=26)、模型組(n=26)3組,并設(shè)立假手術(shù)組為正常對(duì)照組(n=26)。連續(xù)藥物干預(yù)15天,同時(shí)停藥。藥物
7、干預(yù)結(jié)束后每組隨機(jī)選擇6只小鼠,于動(dòng)情前期處死,取其卵巢組織行組織形態(tài)學(xué)觀察。藥物干預(yù)第15天傍晚行交配實(shí)驗(yàn),雌雄比4∶1,連續(xù)合籠15天。大體解剖觀察4組小鼠妊娠結(jié)局和胚胎情況,以及EM模型小鼠的內(nèi)異灶、盆腔粘連情況。對(duì)4組小鼠肝、脾、腎臟進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。ELISA方法檢測腹腔液中炎癥因子IL-2、IL-6和IL-10的水平。通過交配實(shí)驗(yàn)、大體解剖和卵巢組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果,了解內(nèi)異方對(duì)EM模型小鼠生殖能力的影
8、響,及對(duì)卵泡發(fā)育、盆腔微環(huán)境和盆腔粘連的改善作用。
結(jié)果:
1、用模擬經(jīng)期內(nèi)膜組織腹腔注射的方法可成功建立EM小鼠模型(成模率達(dá)100%)。熒光穿透性較差,小動(dòng)物活體成像對(duì)皮下內(nèi)異灶標(biāo)記敏感,對(duì)腹盆腔深部病灶的觀察仍需剖腹后再行拍攝。普通模型組和EGFP模型組兩組小鼠建模情況比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用普通模型組的EM小鼠作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。
2、EM模型小鼠的妊娠率明顯下降(P<0.0
9、5),動(dòng)情間期模型組不孕鼠血清中FSH、PRL水平發(fā)生異常改變(P<0.01),LH、CA125水平未見明顯變化(P>0.05),腹腔液中IL-2水平顯著升高(P<0.01)。EM模型小鼠動(dòng)情周期規(guī)律,模型組小鼠無論妊娠與否,其內(nèi)異灶個(gè)數(shù)、體積、粘連評(píng)分的比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組織形態(tài)學(xué)觀察顯示模型組小鼠的卵巢顆粒細(xì)胞間有較多炎性細(xì)胞浸潤;與假手術(shù)組比較,模型組小鼠始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡構(gòu)成比明顯下降,閉鎖卵泡構(gòu)成比
10、顯著升高(P<0.01)。
3、內(nèi)異方組小鼠的妊娠率明顯提高(P<0.05)。內(nèi)異方組小鼠內(nèi)異灶個(gè)數(shù)減少、體積縮小,粘連評(píng)分降低(P<0.01)。卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察顯示內(nèi)異方組始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡構(gòu)成比高于模型組、孕三烯酮組,閉鎖卵泡構(gòu)成比低于模型組和孕三烯酮組。在改善EM模型小鼠卵巢各級(jí)卵泡構(gòu)成比方面,內(nèi)異方優(yōu)于孕三烯酮(P<0.05),孕三烯酮并不能改善EM小鼠各級(jí)卵泡構(gòu)成比(P>0.05)。模型組小鼠腹腔液中IL
11、-2、IL-6水平均發(fā)生異常升高(P<0.01),IL-10水平發(fā)生明顯降低(P<0.05)。藥物干預(yù)作用下內(nèi)異方組和孕三烯酮組小鼠的腹腔液中IL-2、IL-6水平均顯著下降,孕三烯酮組小鼠的腹腔液中IL-10水平明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。孕三烯酮組小鼠妊娠率未能改善,且藥物處理后體重、肝臟濕重、腎臟濕重均減輕。與孕三烯酮相比,內(nèi)異方藥物毒副性極小,未見肝脾腎損害。
結(jié)論:
1、用模擬經(jīng)期內(nèi)膜組織成功地建立了EM小鼠模
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