加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的作用機(jī)制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥，endometriosis，EM)，是指具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮體以外的部位的一種疾病。近年內(nèi)異癥發(fā)病率明顯上升，痛經(jīng)、不孕、性交痛等作為其重要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。內(nèi)異癥一般多見(jiàn)于生育年齡婦女，絕大多數(shù)發(fā)生在卵巢，常常形成子宮內(nèi)膜異位囊腫。內(nèi)異癥為良性病變，但具有惡性腫瘤相似的種植、浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，少數(shù)子宮內(nèi)膜異位囊腫可發(fā)生惡變形成繼發(fā)性卵巢子宮內(nèi)膜樣癌，也被稱(chēng)為“b

2、egincancer”。 免疫學(xué)概念的引入，對(duì)深入理解內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生重要影響。過(guò)去提出的經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)，曾為內(nèi)異癥的發(fā)生提供了有力依據(jù)。但近年來(lái)有學(xué)者認(rèn)為，在周期性行經(jīng)的婦女中，經(jīng)血逆流至盆腔是普遍的生理現(xiàn)象，卻并非每個(gè)人都發(fā)病，而全身各部位內(nèi)異癥，相對(duì)于理論上子宮內(nèi)膜組織通過(guò)血流和淋巴向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可能形成的內(nèi)異癥大為少見(jiàn)，推測(cè)可能是因?yàn)闄C(jī)體免疫系統(tǒng)不能清除異位內(nèi)膜碎片及排斥異位內(nèi)膜的種植而發(fā)病。大量研究已發(fā)現(xiàn)，患者常伴有局

3、部及全身細(xì)胞免疫和體液免疫功能異常，主要表現(xiàn)為免疫抑制和免疫刺激的不平衡狀態(tài)。由于細(xì)胞免疫和體液免疫失衡，其產(chǎn)生的免疫分子包括細(xì)胞因子的含量及活性改變，以及產(chǎn)生自身抗體和導(dǎo)致補(bǔ)體沉積，可改變腹腔內(nèi)環(huán)境，利于異位內(nèi)膜種植和生長(zhǎng)，并干擾生殖過(guò)程而致不孕。研究表明免疫機(jī)制在異位內(nèi)膜的種植、定位、黏附及生長(zhǎng)增殖過(guò)程中均起重要作用，內(nèi)異癥的發(fā)病與機(jī)體免疫功能異常，尤其是與維持自身穩(wěn)定的免疫監(jiān)視及防御功能缺陷有關(guān)[1]。在傳統(tǒng)的幾種學(xué)說(shuō)基礎(chǔ)上，從內(nèi)

4、異癥患者免疫機(jī)制方面探索包括患者腹腔內(nèi)環(huán)境免疫功能的變化成為研究關(guān)注重點(diǎn)。 在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，從中醫(yī)對(duì)內(nèi)異癥的瘀血致病已積累一定認(rèn)識(shí)。用中藥可明顯改善內(nèi)異癥患者的血液流變學(xué)狀態(tài)，并從神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多途徑達(dá)到治療目的。如通過(guò)調(diào)節(jié)血漿前列腺水平、血清內(nèi)分泌激素的含量、β-內(nèi)啡肽水平等，抑制子宮過(guò)強(qiáng)收縮、緩解子宮缺血及消散局部炎癥反應(yīng)而緩解痛經(jīng)、盆腔痛，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能使機(jī)體處于平衡狀態(tài)，都充分展現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)的整體觀念和辨證

5、論治思想與現(xiàn)代技術(shù)發(fā)展相融合的重要成果，體現(xiàn)出中醫(yī)藥治療的臨床優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，文獻(xiàn)報(bào)道，在幾乎所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都包括了組織形態(tài)學(xué)研究的內(nèi)容，進(jìn)一步揭示了內(nèi)異癥動(dòng)物模型本身的趨向成熟和存在的不足。 因此，本課題中，以擬定的活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)、益氣化痰之加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方，從免疫學(xué)角度探索該方治療內(nèi)異癥的作用機(jī)理。 第一部分加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠子宮內(nèi)膜抗體及組織病理學(xué)改變的影響 [目的]觀察加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方對(duì)內(nèi)異

6、癥大鼠EMAb及組織病理學(xué)改變的影響，為加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方治療內(nèi)異癥提供病理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法]采用自身內(nèi)膜種植方法建立內(nèi)異癥大鼠模型，用加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方治療，設(shè)達(dá)那唑?qū)φ战M。 1.血清EMAb的測(cè)定：各組大鼠取血3ml，3000r/min離心，取上清液，采用ELISA法測(cè)定血清EMAb，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。 2.光鏡及透射電鏡觀察組織學(xué)形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)改變：取正常對(duì)照組在位子宮內(nèi)膜，模型組、各劑量組的異位子宮內(nèi)膜

7、組織，每個(gè)標(biāo)本一分為二，一部分用10％多聚甲醛液固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察內(nèi)膜組織的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。另一部分用2.5％戊二醛固定2h后，磷酸鹽緩沖液沖洗，鋨酸固定1h，系列乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂常規(guī)包埋，半薄切片定位，LKBV型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，H-600透射電鏡觀察超微組織結(jié)構(gòu)。 [結(jié)果]模型組EMAb陽(yáng)性率增高，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異(

8、P＜0.01)；加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方大劑量組EMAb陽(yáng)性率降低，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)；達(dá)那唑組與模型組相比EMAb陽(yáng)性率顯著降低(P＜0.05)。加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方大、中劑量組EMAb陽(yáng)性率與達(dá)那唑組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方小劑量組EMAb陽(yáng)性率與達(dá)那唑組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方大劑量組及達(dá)那唑組EMAb陽(yáng)性率與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方中、小

9、劑量組EMAb陽(yáng)性率與正常對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。 蘇木素-伊紅(haematoxylin-esin，HE)染色，病理組織學(xué)研究顯示，正常對(duì)照組在位子宮內(nèi)膜腺上皮呈柱狀，內(nèi)膜腺體較豐富，腺腔大。模型組異位子宮內(nèi)膜粘膜上皮呈柱狀，內(nèi)膜腺體較稀少。加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方各劑量治療組異位內(nèi)膜組織腺體數(shù)量極少甚或消失，腺腔小，內(nèi)膜粘膜表面為立方上皮或單層扁平上皮，內(nèi)膜變薄。達(dá)那唑組異位內(nèi)膜表面呈矮立方上皮，內(nèi)膜極薄，腺體消失。

10、 電鏡觀察顯示，正常對(duì)照組在位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈柱狀，排列緊密，微絨毛密集；腺上皮細(xì)胞界線清楚，形態(tài)大小正常；細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，極少有凹凸邊跡，核膜界線清楚；胞漿內(nèi)含較多的線粒體，呈圓形或桿狀，板狀嵴，發(fā)育良好；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體較少。模型組異位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞之間連接復(fù)合體發(fā)育良好；腺腔狹窄，微絨毛部分脫落；細(xì)胞界線基本清晰，胞漿內(nèi)含較多線粒體，多呈圓形；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少；核膜界線清晰，局部出現(xiàn)凹凸切跡，少數(shù)異染色質(zhì)

11、集聚靠近核膜。達(dá)那唑組異位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈柱狀，排列緊密，細(xì)胞間連接復(fù)合體發(fā)育較差；細(xì)胞腔面微絨毛稀少；胞漿內(nèi)含較多線粒體，多數(shù)腫脹呈圓形，嵴多消失，基質(zhì)空亮；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體較少；核位于基底部，核膜出現(xiàn)多個(gè)凹陷性深切跡，異染色質(zhì)分布均勻。加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方大劑量組異位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列緊密；細(xì)胞腔面微絨毛稀少；細(xì)胞界線不清，胞核固縮，形態(tài)極不規(guī)則，向多處伸出指狀突起；胞漿內(nèi)含較多線粒體，明顯腫大呈圓形，嵴消失，基質(zhì)空亮；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稀

12、少。 [結(jié)論]加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方通過(guò)改善異位內(nèi)膜的病理組織學(xué)形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，抑制內(nèi)異癥時(shí)EMAb表達(dá)，影響其免疫病理效應(yīng)，從而達(dá)到治療本病的目的。 第二部分加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液白介素-8、白介素-13含量的影響 [目的]研究加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方對(duì)內(nèi)異癥大鼠腹腔液中IL-8、IL-13含量的影響，以探求該藥物的作用機(jī)理。 [方法]采用自身內(nèi)膜種植方法建立內(nèi)異癥動(dòng)物模型，用加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方治療，設(shè)達(dá)那

13、唑?qū)φ战M，各組大鼠，于末次給藥24h后處死，打開(kāi)腹腔，生理鹽水2～3ml沖洗腹腔，收集腹腔液，置于肝素化無(wú)菌離心管中，以2000r/min離心10min，收集上清液待測(cè)。采用ELISA法測(cè)定內(nèi)異癥大鼠腹腔液中IL-8、IL-13含量的影響。 [結(jié)論]內(nèi)異癥大鼠腹腔內(nèi)環(huán)境存在免疫功能異常，而加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方能改善內(nèi)異癥大鼠腹腔內(nèi)環(huán)境的白介素類(lèi)細(xì)胞因子含量的異常狀態(tài)，從而達(dá)到治療內(nèi)異癥的效果。提示加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方治療內(nèi)異癥的免疫作用機(jī)制

14、。 第三部分加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2及其組織抑制劑-2表達(dá)的影響 [目的]研究MMP-2及TIMP-2在內(nèi)異癥發(fā)生中的變化，探討加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方可能的調(diào)控影響和對(duì)內(nèi)異癥治療的作用機(jī)制. [方法]采用自身內(nèi)膜種植方法建立內(nèi)異癥大鼠模型，加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方治療，設(shè)達(dá)那唑?qū)φ战M，各組大鼠，于末次給藥24h后，打開(kāi)腹腔，取下正常對(duì)照組的在位內(nèi)膜組織及模型組、各劑量組的異位內(nèi)膜組織，用1

15、0％甲醛液固定，常規(guī)脫水及石蠟包埋。采用SABC免疫組化染色法檢測(cè)MMP-2、TIMP-2的表達(dá)。 [結(jié)論]加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方能調(diào)控MMP-2、TIMP-2，通過(guò)調(diào)控影響作用于細(xì)胞外基質(zhì)，起到治療內(nèi)異癥的作用。 第四部分加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響 [目的]探討VEGF在內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制中的作用，觀察加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方對(duì)VEGF的影響及對(duì)內(nèi)異癥治療的作用影響。 [方法]

16、采用自身內(nèi)膜種植方法建立內(nèi)異癥大鼠模型，加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方治療，設(shè)達(dá)那唑?qū)φ战M，各組大鼠，于末次給藥24h后，打開(kāi)腹腔，取下模型組、各劑量組的異位內(nèi)膜組織及正常對(duì)照組的在位內(nèi)膜組織，用10％的甲醛液固定，常規(guī)脫水及石蠟切片，免疫組化SABC法檢測(cè)VEGF表達(dá)。 [結(jié)果]免疫組化染色光鏡觀察VEGF陽(yáng)性蛋白呈棕黃色顆粒，主要位于胞漿內(nèi)。模型組VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞高表達(dá)，與正常對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方大

17、、中劑量組及達(dá)那唑組異位內(nèi)膜組織中VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)均明顯降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01，)；加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方小劑量組異位內(nèi)膜組織中VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞也呈低表達(dá)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方大、中劑量組與達(dá)那唑組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方小劑量組與達(dá)那唑組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。加味散結(jié)鎮(zhèn)痛方大劑量組及達(dá)那唑組與正常對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.0