加味散結鎮(zhèn)痛方治療大鼠子宮內膜異位癥的作用機制研究.pdf

1、子宮內膜異位癥(簡稱內異癥，endometriosis，EM)，是指具有生長功能的子宮內膜組織(腺體和間質)出現(xiàn)在子宮體以外的部位的一種疾病。近年內異癥發(fā)病率明顯上升，痛經、不孕、性交痛等作為其重要臨床表現(xiàn)，嚴重影響患者生活質量。內異癥一般多見于生育年齡婦女，絕大多數(shù)發(fā)生在卵巢，常常形成子宮內膜異位囊腫。內異癥為良性病變，但具有惡性腫瘤相似的種植、浸潤和遠處轉移能力，少數(shù)子宮內膜異位囊腫可發(fā)生惡變形成繼發(fā)性卵巢子宮內膜樣癌，也被稱為“b

2、egincancer”。 免疫學概念的引入，對深入理解內異癥發(fā)病機制產生重要影響。過去提出的經血逆流種植學說，曾為內異癥的發(fā)生提供了有力依據(jù)。但近年來有學者認為，在周期性行經的婦女中，經血逆流至盆腔是普遍的生理現(xiàn)象，卻并非每個人都發(fā)病，而全身各部位內異癥，相對于理論上子宮內膜組織通過血流和淋巴向遠處轉移可能形成的內異癥大為少見，推測可能是因為機體免疫系統(tǒng)不能清除異位內膜碎片及排斥異位內膜的種植而發(fā)病。大量研究已發(fā)現(xiàn)，患者常伴有局

3、部及全身細胞免疫和體液免疫功能異常，主要表現(xiàn)為免疫抑制和免疫刺激的不平衡狀態(tài)。由于細胞免疫和體液免疫失衡，其產生的免疫分子包括細胞因子的含量及活性改變，以及產生自身抗體和導致補體沉積，可改變腹腔內環(huán)境，利于異位內膜種植和生長，并干擾生殖過程而致不孕。研究表明免疫機制在異位內膜的種植、定位、黏附及生長增殖過程中均起重要作用，內異癥的發(fā)病與機體免疫功能異常，尤其是與維持自身穩(wěn)定的免疫監(jiān)視及防御功能缺陷有關[1]。在傳統(tǒng)的幾種學說基礎上，從內

4、異癥患者免疫機制方面探索包括患者腹腔內環(huán)境免疫功能的變化成為研究關注重點。 在臨床和動物實驗研究中，從中醫(yī)對內異癥的瘀血致病已積累一定認識。用中藥可明顯改善內異癥患者的血液流變學狀態(tài)，并從神經、內分泌、免疫等多途徑達到治療目的。如通過調節(jié)血漿前列腺水平、血清內分泌激素的含量、β-內啡肽水平等，抑制子宮過強收縮、緩解子宮缺血及消散局部炎癥反應而緩解痛經、盆腔痛，通過調節(jié)免疫功能使機體處于平衡狀態(tài)，都充分展現(xiàn)了中醫(yī)學的整體觀念和辨證

5、論治思想與現(xiàn)代技術發(fā)展相融合的重要成果，體現(xiàn)出中醫(yī)藥治療的臨床優(yōu)勢。同時，文獻報道，在幾乎所有的動物實驗中都包括了組織形態(tài)學研究的內容，進一步揭示了內異癥動物模型本身的趨向成熟和存在的不足。 因此，本課題中，以擬定的活血化瘀，軟堅散結、益氣化痰之加味散結鎮(zhèn)痛方，從免疫學角度探索該方治療內異癥的作用機理。 第一部分加味散結鎮(zhèn)痛方對子宮內膜異位癥大鼠子宮內膜抗體及組織病理學改變的影響 [目的]觀察加味散結鎮(zhèn)痛方對內異

6、癥大鼠EMAb及組織病理學改變的影響，為加味散結鎮(zhèn)痛方治療內異癥提供病理學實驗依據(jù)。 [方法]采用自身內膜種植方法建立內異癥大鼠模型，用加味散結鎮(zhèn)痛方治療，設達那唑對照組。 1.血清EMAb的測定：各組大鼠取血3ml，3000r/min離心，取上清液，采用ELISA法測定血清EMAb，操作按試劑盒說明進行。 2.光鏡及透射電鏡觀察組織學形態(tài)及其超微結構改變：取正常對照組在位子宮內膜，模型組、各劑量組的異位子宮內膜

7、組織，每個標本一分為二，一部分用10％多聚甲醛液固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察內膜組織的組織形態(tài)學結構。另一部分用2.5％戊二醛固定2h后，磷酸鹽緩沖液沖洗，鋨酸固定1h，系列乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂常規(guī)包埋，半薄切片定位，LKBV型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，H-600透射電鏡觀察超微組織結構。 [結果]模型組EMAb陽性率增高，與正常對照組相比有顯著性差異(

8、P＜0.01)；加味散結鎮(zhèn)痛方大劑量組EMAb陽性率降低，與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)；達那唑組與模型組相比EMAb陽性率顯著降低(P＜0.05)。加味散結鎮(zhèn)痛方大、中劑量組EMAb陽性率與達那唑組相比，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；加味散結鎮(zhèn)痛方小劑量組EMAb陽性率與達那唑組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。加味散結鎮(zhèn)痛方大劑量組及達那唑組EMAb陽性率與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；加味散結鎮(zhèn)痛方中、小

9、劑量組EMAb陽性率與正常對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。 蘇木素-伊紅(haematoxylin-esin，HE)染色，病理組織學研究顯示，正常對照組在位子宮內膜腺上皮呈柱狀，內膜腺體較豐富，腺腔大。模型組異位子宮內膜粘膜上皮呈柱狀，內膜腺體較稀少。加味散結鎮(zhèn)痛方各劑量治療組異位內膜組織腺體數(shù)量極少甚或消失，腺腔小，內膜粘膜表面為立方上皮或單層扁平上皮，內膜變薄。達那唑組異位內膜表面呈矮立方上皮，內膜極薄，腺體消失。

10、 電鏡觀察顯示，正常對照組在位子宮內膜上皮細胞呈柱狀，排列緊密，微絨毛密集；腺上皮細胞界線清楚，形態(tài)大小正常；細胞核形態(tài)規(guī)則，極少有凹凸邊跡，核膜界線清楚；胞漿內含較多的線粒體，呈圓形或桿狀，板狀嵴，發(fā)育良好；粗面內質網和溶酶體較少。模型組異位子宮內膜上皮細胞排列緊密，細胞之間連接復合體發(fā)育良好；腺腔狹窄，微絨毛部分脫落；細胞界線基本清晰，胞漿內含較多線粒體，多呈圓形；粗面內質網較少；核膜界線清晰，局部出現(xiàn)凹凸切跡，少數(shù)異染色質

11、集聚靠近核膜。達那唑組異位子宮內膜上皮細胞呈柱狀，排列緊密，細胞間連接復合體發(fā)育較差；細胞腔面微絨毛稀少；胞漿內含較多線粒體，多數(shù)腫脹呈圓形，嵴多消失，基質空亮；粗面內質網和溶酶體較少；核位于基底部，核膜出現(xiàn)多個凹陷性深切跡，異染色質分布均勻。加味散結鎮(zhèn)痛方大劑量組異位子宮內膜上皮細胞排列緊密；細胞腔面微絨毛稀少；細胞界線不清，胞核固縮，形態(tài)極不規(guī)則，向多處伸出指狀突起；胞漿內含較多線粒體，明顯腫大呈圓形，嵴消失，基質空亮；粗面內質網稀

12、少。 [結論]加味散結鎮(zhèn)痛方通過改善異位內膜的病理組織學形態(tài)及超微結構，抑制內異癥時EMAb表達，影響其免疫病理效應，從而達到治療本病的目的。 第二部分加味散結鎮(zhèn)痛方對子宮內膜異位癥大鼠腹腔液白介素-8、白介素-13含量的影響 [目的]研究加味散結鎮(zhèn)痛方對內異癥大鼠腹腔液中IL-8、IL-13含量的影響，以探求該藥物的作用機理。 [方法]采用自身內膜種植方法建立內異癥動物模型，用加味散結鎮(zhèn)痛方治療，設達那

13、唑對照組，各組大鼠，于末次給藥24h后處死，打開腹腔，生理鹽水2～3ml沖洗腹腔，收集腹腔液，置于肝素化無菌離心管中，以2000r/min離心10min，收集上清液待測。采用ELISA法測定內異癥大鼠腹腔液中IL-8、IL-13含量的影響。 [結論]內異癥大鼠腹腔內環(huán)境存在免疫功能異常，而加味散結鎮(zhèn)痛方能改善內異癥大鼠腹腔內環(huán)境的白介素類細胞因子含量的異常狀態(tài)，從而達到治療內異癥的效果。提示加味散結鎮(zhèn)痛方治療內異癥的免疫作用機制

14、。 第三部分加味散結鎮(zhèn)痛方對子宮內膜異位癥大鼠異位內膜組織中基質金屬蛋白酶-2及其組織抑制劑-2表達的影響 [目的]研究MMP-2及TIMP-2在內異癥發(fā)生中的變化，探討加味散結鎮(zhèn)痛方可能的調控影響和對內異癥治療的作用機制. [方法]采用自身內膜種植方法建立內異癥大鼠模型，加味散結鎮(zhèn)痛方治療，設達那唑對照組，各組大鼠，于末次給藥24h后，打開腹腔，取下正常對照組的在位內膜組織及模型組、各劑量組的異位內膜組織，用1

15、0％甲醛液固定，常規(guī)脫水及石蠟包埋。采用SABC免疫組化染色法檢測MMP-2、TIMP-2的表達。 [結論]加味散結鎮(zhèn)痛方能調控MMP-2、TIMP-2，通過調控影響作用于細胞外基質，起到治療內異癥的作用。 第四部分加味散結鎮(zhèn)痛方對子宮內膜異位癥大鼠異位內膜組織中血管內皮生長因子表達的影響 [目的]探討VEGF在內異癥發(fā)病機制中的作用，觀察加味散結鎮(zhèn)痛方對VEGF的影響及對內異癥治療的作用影響。 [方法]

16、采用自身內膜種植方法建立內異癥大鼠模型，加味散結鎮(zhèn)痛方治療，設達那唑對照組，各組大鼠，于末次給藥24h后，打開腹腔，取下模型組、各劑量組的異位內膜組織及正常對照組的在位內膜組織，用10％的甲醛液固定，常規(guī)脫水及石蠟切片，免疫組化SABC法檢測VEGF表達。 [結果]免疫組化染色光鏡觀察VEGF陽性蛋白呈棕黃色顆粒，主要位于胞漿內。模型組VEGF蛋白陽性細胞高表達，與正常對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；加味散結鎮(zhèn)痛方大

17、、中劑量組及達那唑組異位內膜組織中VEGF蛋白陽性細胞的表達均明顯降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01，)；加味散結鎮(zhèn)痛方小劑量組異位內膜組織中VEGF蛋白陽性細胞也呈低表達，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。加味散結鎮(zhèn)痛方大、中劑量組與達那唑組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；加味散結鎮(zhèn)痛方小劑量組與達那唑組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。加味散結鎮(zhèn)痛方大劑量組及達那唑組與正常對照組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.0