PDCD4在子宮內(nèi)膜異位癥中作用及其機制研究.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜上的腺上皮細胞和間質(zhì)細胞出現(xiàn)在除子宮腔以外的其他部位，例如盆腔、腎上腺、肺，甚至是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。它是一種臨床常見的依賴雌激素的婦科疾病，發(fā)病率約為10％-15％，常見于育齡期女性。子宮內(nèi)膜異位癥主要發(fā)生在卵巢(96.4％)，其次是軟組織(2.8％)、胃腸道(0.3％)還有泌尿道(0.2％)。子宮內(nèi)膜異位癥的臨床癥狀主要表現(xiàn)為慢性盆腔痛，發(fā)生在大約50％病人，特別是在月經(jīng)期。另外，還會導(dǎo)致不

2、孕，發(fā)生率為30％-50％。
　　盡管子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性疾病，但它卻有類似于惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為，如遷移、侵襲以及非限制性惡性增殖?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制與上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)，據(jù)報道大約有10％-15％的子宮內(nèi)膜異位癥患者的內(nèi)膜組織具有更強的侵襲力，極易侵入到相關(guān)的組織及器官上，從而產(chǎn)生一系列嚴重的臨床癥狀，而且深部浸潤型的子宮內(nèi)膜異位癥患者對激素的抵抗治療效果不佳?，F(xiàn)在被大家廣為接受的子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機

3、制是“經(jīng)血逆流學(xué)說”，但幾乎所有的育齡期女性在月經(jīng)時期都會有經(jīng)血逆流的現(xiàn)象，而發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率只有10％-15％左右。隨著越來越多的研究，我國郎景和教授又提出了“在位內(nèi)膜決定論”的假說，即由于子宮內(nèi)膜上某些基因的變化引起了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。但是子宮內(nèi)膜異位癥的在位內(nèi)膜的細胞和分子方面的特性尚未完全闡明，需要進一步的研究，為子宮內(nèi)膜異位癥尋找有效的治療方法。
　　PDCD4最初是作為一個促凋亡因子被發(fā)現(xiàn)的，隨著后來的研

4、究發(fā)現(xiàn)PDCD4還可以通過抑制某些蛋白翻譯和基因轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮抗腫瘤抑制作用。據(jù)報道在多種惡性腫瘤中PDCD4的mRNA和蛋白水平都是明顯下調(diào)的，例如肝癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、胃癌和卵巢癌。PDCD4的過表達可以明顯誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡、周期阻滯、增加腫瘤細胞對藥物的敏感性、抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲及血管形成作用。另外，PDCD4還可作為炎性因子參與肥胖、脂肪組織炎癥、動脈粥樣硬化、LPS/D-GalN誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)生。鑒于PDCD4在腫瘤及炎癥中

5、的作用，我們推測PDCD4在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮著一定的作用。
　　在本研究中，我們檢測子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜以及對照子宮內(nèi)膜中PDCD4的表達，利用體外實驗研究PDCD4過表達或干擾后對子宮內(nèi)膜細胞HEC-1-A和Ishikawa增殖、遷移及侵襲的影響及其機制，同時在原代子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞中進行驗證。
　　本實驗的研究目的是探究PDCD4對子宮內(nèi)膜異位癥的作用，并對其機制進一步探討。通過本研究有利

6、于解釋子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點。
　　實驗方法:
　　1.PDCD4在對照組子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達
　　收集35例對照組子宮內(nèi)膜(control)及26例卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥(EM)患者的在位及異位子宮內(nèi)膜，利用qRT-PCR、western blot及免疫組化檢測對照組子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位及異位子宮內(nèi)膜中PDCD4 mRNA及蛋白表達水平。
　　

7、2.雌二醇、孕酮對子宮內(nèi)膜細胞中PDCD4表達水平的影響
　　利用不同濃度的雌二醇（0.1nM、1nM、10nM、100nM和1000nM）刺激子宮內(nèi)膜細胞HEC-1-A和Ishikawa，然后檢測PDCD4表達水平。利用不同濃度的孕酮（0.01uM、0.1uM、1uM、10uM和20uM）刺激HEC-1-A和Ishikawa細胞，48h后收集蛋白，然后檢測PDCD4表達變化。然后，用10uM的孕酮刺激HEC-1-A和Ishika

8、wa細胞不同的時間點(6h，12h，24h，36h，48h)，檢測PDCD4表達水平的變化。
　　3.PDCD4對子宮內(nèi)膜細胞的增殖、遷移及侵襲的影響
　　我們首先在RNA水平和蛋白水平檢測子宮內(nèi)膜細胞HEC-1-A和Ishikawa細胞中PDCD4的表達水平，發(fā)現(xiàn)PDCD4在Ishikawa細胞中相對高表達，在HEC-1-A細胞中低表達。利用PDCD4過表達載體(pEGFP-C1-PDCD4)轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishik

9、awa細胞，轉(zhuǎn)染24h后利用CCK8試劑盒、克隆形成及Transwell實驗檢測PDCD4對細胞增殖、遷移及侵襲的影響，在Ishikawa細胞中用兩種siRNA轉(zhuǎn)染干擾PDCD4以后對細胞增殖、遷移及侵襲的的影響。
　　4.PDCD4在子宮內(nèi)膜細胞中對細胞周期及凋亡的影響
　　利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishikawa細胞（過表達或干擾PDCD4）48h后對細胞周期的影響及轉(zhuǎn)染24h對細胞凋亡的作用。
　　

10、5.PDCD4對子宮內(nèi)膜細胞自噬水平的影響
　　利用western blot方法分別檢測過表達HEC-1-A細胞24h后的蛋白和干擾Ishikawa細胞48h后的蛋白中自噬標志物L(fēng)C3B的表達變化。
　　6.PDCD4抑制子宮內(nèi)膜細胞的遷移和侵襲相關(guān)機制
　　利用PDCD4過表達載體轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishikawa細胞，或利用特異性針對PDCD4的兩種siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞，轉(zhuǎn)染24h后分別收蛋白，利用

11、westernblot實驗檢測p-P65、MMP2和MMP9的表達情況，探討PDCD4對遷移及侵襲作用的機制。
　　7.PDCD4對原代子宮內(nèi)膜腺上皮細胞及間質(zhì)細胞增殖和遷移的作用及其機制
　　分離培養(yǎng)處于分泌期子宮內(nèi)膜的腺上皮細胞及間質(zhì)細胞。利用免疫細胞化學(xué)檢測腺上皮細胞標志物（角蛋白）及間質(zhì)細胞標志物（波形蛋白）的表達鑒別細胞類別，用CCK8試劑盒檢測PDCD4對原代腺上皮細胞及間質(zhì)細胞增殖能力的影響。然后又利用Tran

12、swell實驗檢測PDCD4對原代腺上皮細胞及間質(zhì)細胞遷移的影響。進一步利用western blot實驗檢測在原代腺上皮細胞和間質(zhì)細胞中過表達PDCD4或干擾PDCD4后p-P65、MMP2和MMP9的表達情況，探討PDCD4抑制細胞遷移的機制。
　　實驗結(jié)果:
　　1.在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中PDCD4表達明顯降低
　　利用qRT-PCR和western blot檢測結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮

13、內(nèi)膜中PDCD4的表達低于對照子宮內(nèi)膜。免疫組化的結(jié)果顯示PDCD4表達主要位于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的胞漿中，而在間質(zhì)細胞中幾乎不表達。與對照組子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中PDCD4的表達明顯降低。同時發(fā)現(xiàn)對照組子宮內(nèi)膜中位于增生期的內(nèi)膜PDCD4表達明顯高于分泌期的內(nèi)膜，另外，與對照組處于增生期的子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者增生期的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中PDCD4的表達明顯降低。
　　2.孕酮在子宮內(nèi)膜細

14、胞中可以下調(diào)PDCD4表達，雌二醇對PDCD4的表達沒有明顯的影響
　　分別用不同濃度的孕酮、雌二醇刺激子宮內(nèi)膜上皮細胞后收集蛋白，發(fā)現(xiàn)孕酮能夠明顯下調(diào)子宮內(nèi)膜細胞PDCD4蛋白的表達，但雌二醇對PDCD4的表達沒有明顯的影響;利用濃度10uM的孕酮分別刺激細胞不同的時間也可以明顯下調(diào)PDCD4蛋白的表達。
　　3.PDCD4抑制子宮內(nèi)膜細胞的增殖及克隆形成能力
　　利用PDCD4過表達載體轉(zhuǎn)染HEC-1-A和Ishi

15、kawa細胞，轉(zhuǎn)染24h后檢測PDCD4對細胞增殖的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PDCD4過表達載體后可明顯抑制細胞增殖能力，在Ishikawa細胞中用兩種siRNA轉(zhuǎn)染細胞干擾PDCD4以后結(jié)果顯示PDCD4 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞活力明顯高于對照siRNA轉(zhuǎn)染組。利用克隆形成實驗檢測PDCD4對細胞克隆形成能力的影響，結(jié)果顯示過表達PDCD4后可明顯抑制HEC-1-A和Ishikawa細胞的克隆形成能力，在Ishikawa細胞中用兩種siRNA

16、轉(zhuǎn)染干擾PDCD4以后細胞的克隆形成能力明顯上調(diào)。
　　4.PDCD4在子宮內(nèi)膜細胞中對細胞周期及凋亡沒有明顯的作用
　　利用流式細胞術(shù)檢測PDCD4對細胞周期的影響，結(jié)果顯示無論過表達或干擾PDCD4對細胞周期都沒有明顯的影響。同時也利用流式細胞術(shù)檢測PDCD4對細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示無論過表達或干擾PDCD4對細胞凋亡都沒有明顯的影響。
　　5.PDCD4能夠抑制子宮內(nèi)膜細胞的自噬水平
　　利用PDCD4過

17、表達載體或siRNA轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染48h后收蛋白，結(jié)果顯示過表達PDCD4后，LC3B表達水平明顯降低;下調(diào)細胞PDCD4后，LC3B表達水平明顯升高。
　　6.PDCD4可以抑制子宮內(nèi)膜細胞的遷移和侵襲作用
　　利用PDCD4過表達載體轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染24h后做Transwell實驗，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染PDCD4過表達載體的Ishikawa細胞遷移的細胞數(shù)明顯低于空載體轉(zhuǎn)染組，在HEC-1-A細胞中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。利用特異性

18、針對PDCD4的兩種siRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞，結(jié)果顯示PDCD4 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中遷移的細胞數(shù)目明顯的多于對照siRNA轉(zhuǎn)染組。同時利用Transwell實驗（鋪基質(zhì)膠）檢測過表達PDCD4后對細胞侵襲的影響，結(jié)果顯示PDCD4過表達后可明顯抑制HEC-1-A和Ishikawa細胞的侵襲能力，干擾PDCD4后則明顯的促進Ishikawa細胞的侵襲能力。
　　7.PDCD4通過抑制NF-κB/MMP2/MMP9通路抑

19、制子宮內(nèi)膜細胞的遷移和侵襲
　　利用western blot實驗探討PDCD4抑制遷移及侵襲的機制，結(jié)果顯示在HEC-1-A細胞過表達PDCD4以后，p-P65、MMP2和MMP9的表達明顯的降低。對Ishikawa細胞干擾PDCD4以后發(fā)現(xiàn)p-P65、MMP2和MMP9的表達明顯的升高。
　　8.PDCD4抑制原代子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、間質(zhì)細胞的遷移和增殖
　　為了進一步的驗證PDCD4在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用，分離培

20、養(yǎng)正常的位于分泌期的子宮內(nèi)膜的腺上皮細胞及間質(zhì)細胞。用CCK8試劑盒檢測PDCD4對原代腺上皮細胞及間質(zhì)細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示在原代細胞中過表達PDCD4后明顯抑制細胞的增殖，干擾PDCD4后明顯的促進細胞的增殖。然后又利用Transwell實驗檢測PDCD4對原代腺上皮細胞及間質(zhì)細胞遷移作用的影響，結(jié)果顯示在原代細胞中過表達PDCD4后明顯抑制細胞的遷移，干擾PDCD4后明顯的促進細胞的遷移。
　　9.PDCD4通過抑制N

21、F-κB/MMP2/MMP9通路抑制原代子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、間質(zhì)細胞的遷移
　　進一步利用western blot實驗探討在原代腺上皮細胞及間質(zhì)細胞中PDCD4抑制遷移的機制，結(jié)果顯示在原代細胞過表達PDCD4以后，p-P65、MMP2和MMP9的表達明顯的降低。在原代細胞中干擾PDCD4以后發(fā)現(xiàn)p-P65、MMP2和MMP9的表達明顯的升高。
　　實驗結(jié)論:
　　1.PDCD4在對照子宮內(nèi)膜的表達明顯高于子宮內(nèi)膜異位

22、癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達。
　　2.孕酮可以下調(diào)子宮內(nèi)膜細胞中PDCD4表達水平，雌二醇對子宮內(nèi)膜細胞中PDCD4的表達沒有明顯的作用。
　　3.PDCD4能夠明顯抑制子宮內(nèi)膜細胞的增殖及克隆形成能力，但對細胞周期及凋亡沒有明顯的作用。
　　4.PDCD4可以抑制子宮內(nèi)膜細胞的自噬水平。
　　5.PDCD4可以通過NF-κB/MMP2/MMP9通路抑制子宮內(nèi)膜細胞的遷移和侵襲作用。
　　6.PDC

23、D4可以抑制原代子宮內(nèi)膜腺上皮細胞及間質(zhì)細胞的遷移和增殖，抑制遷移的機制與NF-κB/MMP2/MMP9通路有關(guān)。
　　創(chuàng)新性及意義:
　　1.首次探討了PDCD4與子宮內(nèi)膜異位癥之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PDCD4在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達明顯降低。
　　2.在體外，PDCD4可以明顯抑制子宮內(nèi)膜細胞的增殖、克隆形成能力、遷移及侵襲作用。
　　3.我們的研究發(fā)現(xiàn)可能為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供一個新的治