人卵巢片段化處理聯合AKT刺激物對始基卵泡體外激活的作用研究.pdf

1、研究目的：
　　卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)通常是指女性在于40歲以前出現閉經，伴隨著持續(xù)雌激素水平降低和促性腺激素水平的升高等內分泌紊亂。全球范圍內的流行學調查顯示，POF的發(fā)病率為1-2％，但有逐年增高的趨勢。目前，大部分POF患者的病因是不明確的，對于無生育要求的患者，激素替代治療可緩解她們提前出現的更年期癥狀。然而在那些尚未生育或仍有生育需求的患者中，由于常規(guī)的輔助生殖技術難以獲得

2、成熟高質量的卵子，因此無法發(fā)揮相應作用，這也成為POF輔助生殖治療最為棘手的難題。
　　對于大部分POF患者來說，贈卵的體外受精-胚胎移植技術是最為有效的辦法，但因法律、倫理和人們思想觀念的限制，難以滿足POF患者的生育需求。有研究顯示，大部分POF患者卵巢皮質內仍殘存一些處于休眠狀態(tài)的始基卵泡，但是這部分卵泡對促性腺激素無反應能力，故無法正常發(fā)育、成熟。如何保存這部分可能存在潛在生育功能的始基卵泡并激活使其生長發(fā)育，獲得有效卵子

3、成為POF患者輔助生殖治療新的突破口。
　　現階段，生育力保存的常用方法有胚胎冷凍、卵母細胞冷凍、卵母細胞體外成熟和卵巢組織冷凍等。然而，對于POF患者來說，無法獲得成熟或未成熟的卵子，更無法應用成熟的卵子在體外與精子受精形成胚胎，故胚胎冷凍、卵母細胞冷凍和卵母細胞體外成熟的方式無法成為POF患者保存生育力的方法。這使得卵巢組織冷凍技術成為POF患者保存生育力的僅存方式。卵巢組織冷凍可分為玻璃化冷凍和慢速程序化冷凍兩種方式。越來越

4、多的研究顯示玻璃化冷凍技術較傳統(tǒng)的慢速冷凍更為簡單、高效。
　　近年來，如何激活休眠狀態(tài)的始基卵泡成為POF生殖治療的研究熱點。因體內應用激活劑存在腫瘤發(fā)生的風險，故更多研究將將目光聚焦于體外激活。體外激活(invitro activation)技術是將卵巢組織從患者體內取出，進行一定的處理或使用激活劑，激活卵巢組織中處于休眠狀態(tài)的卵泡繼續(xù)發(fā)育，再將卵巢組織移植回患者體內，以期獲得成熟卵泡并妊娠。卵巢組織體外培養(yǎng)的實驗顯示，PTE

5、N抑制劑可使用的激活PI3K-AKT信號通路，激活始基卵泡的發(fā)育，人卵巢組織異種移植的研究同樣證實了該作用。Hippo信號通路在哺乳動物體內也廣泛存在，且高度保守，其主要功能為限制組織器官過度生長。日本有學者研究發(fā)現將小鼠卵巢片段化處理為小的卵巢組織塊可阻斷體內Hippo信號通路，促進卵泡發(fā)育。
　　本研究通過對人卵巢組織進行玻璃化冷凍及復蘇，評價玻璃化冷凍及復蘇對卵巢組織冷凍的有效性。并對人卵巢組織進行片段化處理，檢測Hippo

6、信號通路中YAP、pYAP蛋白及CCN生長因子、BIRC凋亡抑制因子的含量變化，證實是否對人卵巢片段化處理后可阻斷Hippo信號通路。將片段化處理后的卵巢組織體外加入AKT刺激物培養(yǎng)后進行裸鼠背闊肌移植，探究是否可體外激活卵泡發(fā)育。
　　研究方法：
　　本課題研究中，我們收集了本院整形科易性病患者（女變男）及婦產科非卵巢因素行卵巢切除術的患者卵巢組織，進行玻璃化冷凍，一段時間后對冷凍的卵巢組織進行解凍復蘇，并利用組織HE染色

7、的方法比較冷凍前后卵巢組織形態(tài)學改變。接著，我們對復蘇后的卵巢組織進行片段化處理，利用免疫組化，比較處理前后YAP蛋白定位變化及CCN3表達量的改變，利用RNA抽提，反轉錄及qPCR技術比較片段化處理后不同時間點CCN及BIRC的表達水平，并運用Western blotting在蛋白水平檢測YAP及CCN3的表達情況。同時，將片段化處理后的卵巢組織加入AKT刺激物進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)后的卵巢組織進行裸鼠背闊肌移植，檢測卵泡發(fā)育情況。

8、>　　研究結果：
　　1.卵巢組織玻璃化冷凍前后無明顯形態(tài)學改變。
　　在對玻璃化冷凍前后卵巢組織HE染色形態(tài)學比較中，冷凍前后卵巢組織內均可見卵巢間質細胞呈梭形排列，前內可見散在分布的始基卵泡，始基卵泡內卵母細胞可見細胞核清晰，呈圓形，卵母細胞周圍包繞一層梭形前顆粒細胞，冷凍復蘇后的卵巢組織HE染色后可見鏡下形態(tài)與冷凍前新鮮卵巢組織無明顯改變。
　　2.片段化處理人卵巢組織可降低p-YAP蛋白含量，顆粒細胞細胞核中Y

9、AP蛋白含量增多。
　　本研究將解凍復蘇后的卵巢組織進行片段化處理，對處理前后卵巢組織內YAP蛋白及p-YAP蛋白含量進行western blotting檢測，結果示處理后1小時卵巢內p-YAP蛋白含量較處理前明顯降低，YAP蛋白無明顯改變，p-YAP/YAP明顯降低。同時，對片段后處理后的卵巢組織進行YAP蛋白的免疫組化檢測，比較YAP蛋白定位變化，可見片段化處理后的卵巢組織內可見顆粒細胞核內YAP蛋白含量增多。
　　3.

10、片段化處理人卵巢組織片后CCN生長因子及BIRC凋亡抑制因子表達量增加。
　　本研究將解凍復蘇后的卵巢組織進行片段化處理，利用RNA抽提，反轉錄及q-PCR技術比較片段化處理后不同時間點CCN及BIRC的表達水平，結果顯示片段化處理后CCN2、CCN3、BIRC1、BIRC7表達量均上升，有統(tǒng)計學意義。western blotting檢測CCN3蛋白水平變化，提示片段化處理后CCN3蛋白水平明顯增高。同時，我們還用運免疫組化的方法

11、檢測CCN3表達變化，結果提示CCN3表達量較處理前明顯增高。
　　4.將片段化處理后的卵巢組織運用AKT刺激物體外培養(yǎng)后可增加p-AKT表達量，裸鼠背闊肌移植未見明顯壞死。
　　本研究通過對片段化處理后的卵巢組織運用AKT刺激物體外培養(yǎng)，利用westernblotting檢測p-AKT蛋白水平變化，結果顯示運用AKT刺激物培養(yǎng)后的卵巢組織內p-AKT蛋白表達量明顯增高。將培養(yǎng)后的卵巢組織移植入裸鼠背闊肌，一段時間后回收卵巢