人卵巢片段化處理聯(lián)合AKT刺激物對(duì)始基卵泡體外激活的作用研究.pdf

1、研究目的：
　　卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)通常是指女性在于40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)，伴隨著持續(xù)雌激素水平降低和促性腺激素水平的升高等內(nèi)分泌紊亂。全球范圍內(nèi)的流行學(xué)調(diào)查顯示，POF的發(fā)病率為1-2％，但有逐年增高的趨勢(shì)。目前，大部分POF患者的病因是不明確的，對(duì)于無生育要求的患者，激素替代治療可緩解她們提前出現(xiàn)的更年期癥狀。然而在那些尚未生育或仍有生育需求的患者中，由于常規(guī)的輔助生殖技術(shù)難以獲得

2、成熟高質(zhì)量的卵子，因此無法發(fā)揮相應(yīng)作用，這也成為POF輔助生殖治療最為棘手的難題。
　　對(duì)于大部分POF患者來說，贈(zèng)卵的體外受精-胚胎移植技術(shù)是最為有效的辦法，但因法律、倫理和人們思想觀念的限制，難以滿足POF患者的生育需求。有研究顯示，大部分POF患者卵巢皮質(zhì)內(nèi)仍殘存一些處于休眠狀態(tài)的始基卵泡，但是這部分卵泡對(duì)促性腺激素?zé)o反應(yīng)能力，故無法正常發(fā)育、成熟。如何保存這部分可能存在潛在生育功能的始基卵泡并激活使其生長(zhǎng)發(fā)育，獲得有效卵子

3、成為POF患者輔助生殖治療新的突破口。
　　現(xiàn)階段，生育力保存的常用方法有胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍、卵母細(xì)胞體外成熟和卵巢組織冷凍等。然而，對(duì)于POF患者來說，無法獲得成熟或未成熟的卵子，更無法應(yīng)用成熟的卵子在體外與精子受精形成胚胎，故胚胎冷凍、卵母細(xì)胞冷凍和卵母細(xì)胞體外成熟的方式無法成為POF患者保存生育力的方法。這使得卵巢組織冷凍技術(shù)成為POF患者保存生育力的僅存方式。卵巢組織冷凍可分為玻璃化冷凍和慢速程序化冷凍兩種方式。越來越

4、多的研究顯示玻璃化冷凍技術(shù)較傳統(tǒng)的慢速冷凍更為簡(jiǎn)單、高效。
　　近年來，如何激活休眠狀態(tài)的始基卵泡成為POF生殖治療的研究熱點(diǎn)。因體內(nèi)應(yīng)用激活劑存在腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，故更多研究將將目光聚焦于體外激活。體外激活(invitro activation)技術(shù)是將卵巢組織從患者體內(nèi)取出，進(jìn)行一定的處理或使用激活劑，激活卵巢組織中處于休眠狀態(tài)的卵泡繼續(xù)發(fā)育，再將卵巢組織移植回患者體內(nèi)，以期獲得成熟卵泡并妊娠。卵巢組織體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)顯示，PTE

5、N抑制劑可使用的激活PI3K-AKT信號(hào)通路，激活始基卵泡的發(fā)育，人卵巢組織異種移植的研究同樣證實(shí)了該作用。Hippo信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物體內(nèi)也廣泛存在，且高度保守，其主要功能為限制組織器官過度生長(zhǎng)。日本有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)將小鼠卵巢片段化處理為小的卵巢組織塊可阻斷體內(nèi)Hippo信號(hào)通路，促進(jìn)卵泡發(fā)育。
　　本研究通過對(duì)人卵巢組織進(jìn)行玻璃化冷凍及復(fù)蘇，評(píng)價(jià)玻璃化冷凍及復(fù)蘇對(duì)卵巢組織冷凍的有效性。并對(duì)人卵巢組織進(jìn)行片段化處理，檢測(cè)Hippo

6、信號(hào)通路中YAP、pYAP蛋白及CCN生長(zhǎng)因子、BIRC凋亡抑制因子的含量變化，證實(shí)是否對(duì)人卵巢片段化處理后可阻斷Hippo信號(hào)通路。將片段化處理后的卵巢組織體外加入AKT刺激物培養(yǎng)后進(jìn)行裸鼠背闊肌移植，探究是否可體外激活卵泡發(fā)育。
　　研究方法：
　　本課題研究中，我們收集了本院整形科易性病患者（女變男）及婦產(chǎn)科非卵巢因素行卵巢切除術(shù)的患者卵巢組織，進(jìn)行玻璃化冷凍，一段時(shí)間后對(duì)冷凍的卵巢組織進(jìn)行解凍復(fù)蘇，并利用組織HE染色

7、的方法比較冷凍前后卵巢組織形態(tài)學(xué)改變。接著，我們對(duì)復(fù)蘇后的卵巢組織進(jìn)行片段化處理，利用免疫組化，比較處理前后YAP蛋白定位變化及CCN3表達(dá)量的改變，利用RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄及qPCR技術(shù)比較片段化處理后不同時(shí)間點(diǎn)CCN及BIRC的表達(dá)水平，并運(yùn)用Western blotting在蛋白水平檢測(cè)YAP及CCN3的表達(dá)情況。同時(shí)，將片段化處理后的卵巢組織加入AKT刺激物進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)后的卵巢組織進(jìn)行裸鼠背闊肌移植，檢測(cè)卵泡發(fā)育情況。

8、>　　研究結(jié)果：
　　1.卵巢組織玻璃化冷凍前后無明顯形態(tài)學(xué)改變。
　　在對(duì)玻璃化冷凍前后卵巢組織HE染色形態(tài)學(xué)比較中，冷凍前后卵巢組織內(nèi)均可見卵巢間質(zhì)細(xì)胞呈梭形排列，前內(nèi)可見散在分布的始基卵泡，始基卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞可見細(xì)胞核清晰，呈圓形，卵母細(xì)胞周圍包繞一層梭形前顆粒細(xì)胞，冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織HE染色后可見鏡下形態(tài)與冷凍前新鮮卵巢組織無明顯改變。
　　2.片段化處理人卵巢組織可降低p-YAP蛋白含量，顆粒細(xì)胞細(xì)胞核中Y

9、AP蛋白含量增多。
　　本研究將解凍復(fù)蘇后的卵巢組織進(jìn)行片段化處理，對(duì)處理前后卵巢組織內(nèi)YAP蛋白及p-YAP蛋白含量進(jìn)行western blotting檢測(cè)，結(jié)果示處理后1小時(shí)卵巢內(nèi)p-YAP蛋白含量較處理前明顯降低，YAP蛋白無明顯改變，p-YAP/YAP明顯降低。同時(shí)，對(duì)片段后處理后的卵巢組織進(jìn)行YAP蛋白的免疫組化檢測(cè)，比較YAP蛋白定位變化，可見片段化處理后的卵巢組織內(nèi)可見顆粒細(xì)胞核內(nèi)YAP蛋白含量增多。
　　3.

10、片段化處理人卵巢組織片后CCN生長(zhǎng)因子及BIRC凋亡抑制因子表達(dá)量增加。
　　本研究將解凍復(fù)蘇后的卵巢組織進(jìn)行片段化處理，利用RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄及q-PCR技術(shù)比較片段化處理后不同時(shí)間點(diǎn)CCN及BIRC的表達(dá)水平，結(jié)果顯示片段化處理后CCN2、CCN3、BIRC1、BIRC7表達(dá)量均上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。western blotting檢測(cè)CCN3蛋白水平變化，提示片段化處理后CCN3蛋白水平明顯增高。同時(shí)，我們還用運(yùn)免疫組化的方法

11、檢測(cè)CCN3表達(dá)變化，結(jié)果提示CCN3表達(dá)量較處理前明顯增高。
　　4.將片段化處理后的卵巢組織運(yùn)用AKT刺激物體外培養(yǎng)后可增加p-AKT表達(dá)量，裸鼠背闊肌移植未見明顯壞死。
　　本研究通過對(duì)片段化處理后的卵巢組織運(yùn)用AKT刺激物體外培養(yǎng)，利用westernblotting檢測(cè)p-AKT蛋白水平變化，結(jié)果顯示運(yùn)用AKT刺激物培養(yǎng)后的卵巢組織內(nèi)p-AKT蛋白表達(dá)量明顯增高。將培養(yǎng)后的卵巢組織移植入裸鼠背闊肌，一段時(shí)間后回收卵巢