環(huán)孢素A聯(lián)合IDO激活劑對(duì)淋巴細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的：⑴了解環(huán)孢素A(CsA)聯(lián)合吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)激活劑(3,4-DAA，曲尼司特，tranilast，TNL)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。探討CsA、3,4-DAA以及二者聯(lián)合治療對(duì)于淋巴細(xì)胞表面Notch1受體mRNA表達(dá)的影響。⑵了解再生障礙性貧血(AA)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)Notch1受體mRNA表達(dá)水平。探討Notch1與AA發(fā)病的相關(guān)性，進(jìn)一步明確AA的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：①細(xì)胞水平：取

2、正常人外周血加淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞并細(xì)胞培養(yǎng)，使用植物凝集素(PHA)刺激淋巴細(xì)胞發(fā)育，接種于96孔板，分別加入不同劑量單純環(huán)孢素A(CsA)，單純IDO激活劑(3,4-DAA)，及二者的聯(lián)合用藥，使用四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖抑制情況。②使用6孔板培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞，加入不同劑量的CsA、3,4-DAA以及二者的聯(lián)合用藥，使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面Notch1受體mRNA表達(dá)水平，比較三組藥物干預(yù)的效果。

3、③利用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR，相對(duì)定量檢測(cè)13例AA患者、7例正常人的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)的Notch1受體mRNA表達(dá)情況，β-actin為內(nèi)參照,根據(jù)相對(duì)定量公式：2-△△Ct計(jì)算患者與正常人Notch1受體mRNA表達(dá)差異倍數(shù)。
　　 結(jié)果：⑴淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示，單獨(dú)使用CsA與3,4-DAA的中效抑制濃度(IC50)分別為0.376和58.086μg/ml。CsA與3,4-DAA單獨(dú)及聯(lián)合使用均可

4、抑制淋巴細(xì)胞增殖。聯(lián)合使用CsA和3,4-DAA的協(xié)同指數(shù)q值大于1.15(金氏公式)，顯示具有協(xié)同作用。⑵實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，CsA組、CsA聯(lián)合IDO激活劑3,4-DAA治療組Notch1受體mRNA表達(dá)均上調(diào)，提示淋巴細(xì)胞表面Notch1受體活化。⑶與正常人相比，再生障礙性貧血(AA)患者Notch1受體mRNA表達(dá)水平下調(diào)，可能是AA患者骨髓增生能力低下的原因之一。
　　 結(jié)論：①本部分研究結(jié)果顯示CsA聯(lián)合IDO激

5、活劑3,4-DAA對(duì)淋巴細(xì)胞抑制效果優(yōu)于單純CsA組或單純3,4-DAA組，CsA聯(lián)合IDO激活劑可協(xié)同抑制淋巴細(xì)胞增長(zhǎng)，減少CsA的治療用量、減輕副作用；另外CsA 聯(lián)合IDO激活劑組可從不同環(huán)節(jié)抑制異?；罨拿庖呦到y(tǒng)、增強(qiáng)免疫耐受，重建免疫平衡。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平上驗(yàn)證前期動(dòng)物試驗(yàn)中得出的聯(lián)合治療有效性的結(jié)論，為再生障礙性貧血治療提出新的治療策略。CsA及聯(lián)合IDO激活劑3,4-DAA組使淋巴細(xì)胞表面Notch1受體mRNA表達(dá)提高，