血管活性腸肽對新生大鼠始基卵泡體外發(fā)育影響的實驗研究.pdf

1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使許多腫瘤、自身免疫疾病和骨髓移植患者得到了臨床上的治愈，卻面臨卵巢功能的嚴(yán)重?fù)p害；同時，越來越多的女性由于職業(yè)競爭壓力的增大而一再推遲生育年齡，給優(yōu)生優(yōu)育帶來了隱患。如何充分利用生殖資源保存女性的生育能力，是一個值得研究的重要課題。 哺乳動物卵巢組織含有數(shù)以百萬計的始基卵泡，組成一個維持雌性哺乳動物—生生殖活動的卵泡庫。隨著個體的生長發(fā)育，始基卵泡離開卵泡靜息池，啟動生長，卵母細(xì)胞恢復(fù)并完成減數(shù)分裂，最后排

2、卵；但是在雌性個體一生的生殖活動中能夠成熟排卵的僅為卵泡庫中極小一部分(<1％)，絕大多數(shù)卵泡在不同的發(fā)育階段閉鎖。充分利用這部分卵泡，將數(shù)百萬個早期卵泡保存起來，在需要的時候進(jìn)行體外培養(yǎng)、成熟，并生育后代，是無數(shù)科學(xué)家多年的夢想。近10多年來，隨著生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在人類由不成熟竇卵泡在體外培養(yǎng)成熟并進(jìn)行體外受精的IVM技術(shù)已經(jīng)取得長足進(jìn)步，而有關(guān)啟動早期卵泡生長發(fā)育成為竇卵泡的研究仍然沒有取得突破；盡管人們已認(rèn)識到在始基卵泡的發(fā)育過程

3、中，卵泡內(nèi)外不同細(xì)胞之間通過縫隙連接進(jìn)行著有效溝通及對話，涉及多種細(xì)胞因子的相互作用，如KIT配體(KL，kit ligand)、抗苗勒氏管激素(AMH，anti—Mullerian hormone)等，然而啟動始基卵泡生長發(fā)育的信號通路尚待闡明。 目前研究顯示，啟動始基卵泡生長發(fā)育的過程是不依賴垂體促性腺激素的，而卵巢局部神經(jīng)的功能活動早于卵泡生長的啟動。神經(jīng)遞質(zhì)血管活性腸肽(vasoactive intestinal pep

4、tide，VIP)在調(diào)控卵泡生長發(fā)育中的作用也引起了學(xué)者們的關(guān)注。作為G蛋白偶聯(lián)受體B家族的成員之一，它的功能作用主要是由高親合力受體VPAC1、VPAC2優(yōu)先結(jié)合Gs蛋白，激活腺苷酸環(huán)化酶活動，通過環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)第二信使系統(tǒng)發(fā)揮生物效應(yīng)。相關(guān)研究已經(jīng)觀察到VIP參與排卵前卵泡的若干功能活動、誘導(dǎo)FSH受體的形成及芳香酶活性的增強(qiáng)，并調(diào)節(jié)竇前卵泡的生長與竇腔形成；最近

5、的研究發(fā)現(xiàn)，VIP不僅出現(xiàn)在生長卵泡的膜細(xì)胞層、竇前卵泡，在始基卵泡周圍也有表達(dá)，提示其參與早期卵泡生長發(fā)育調(diào)控的可能性，但目前仍缺少神經(jīng)肽VIP參與始基卵泡活化與生長發(fā)育機(jī)制的研究，值得我們對此進(jìn)行更深入的研究。 基于當(dāng)前對早期卵泡啟動發(fā)育機(jī)制的研究進(jìn)展，我們設(shè)想神經(jīng)遞質(zhì)VIP可能參與了啟動始基卵泡生長發(fā)育調(diào)控：本實驗采用新生大鼠卵巢體外培養(yǎng)的方法，通過添加VIP、KL，觀察VIP對始基卵泡的啟動是否有作用。 材料與方

6、法: 1.動物來源：雌性SD大鼠購自中山大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心。清潔級，出生4天，體重10-15g。 2.實驗方法：在解剖顯微鏡下完整分離大鼠雙側(cè)卵巢，隨機(jī)分配到各處理組；新鮮對照組直接固定、包埋、切片、染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；基礎(chǔ)培養(yǎng)組以無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，VIP組、KL組分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加VIP、KL，各培養(yǎng)組均在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天；培養(yǎng)結(jié)束后卵巢經(jīng)固定、包埋、切片，進(jìn)行組織病理學(xué)分析、PC

7、NA免疫組化染色，熒光定量PCR檢測KLmRNA的表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)基中甾體激素水平。觀察神經(jīng)肽VIP對早期卵泡的啟動及生長發(fā)育的影響并探討其作用機(jī)制。 結(jié)果: 1.完整卵巢體外培養(yǎng)對早期卵泡體外發(fā)育的影響 新生4天大鼠卵巢在培養(yǎng)過程中，外觀未見異常。培養(yǎng)結(jié)束后組織病理學(xué)觀察顯示，切片上仍有大量健康卵泡存活。在通過卵巢中心的最大徑線切片上計數(shù)健康卵泡總數(shù)，在此基礎(chǔ)上，于200×光鏡下，進(jìn)行各級卵泡分類計數(shù)，

8、在新鮮大鼠卵巢切片上，始基卵泡(0級)在全部卵泡所占比例為66.87±7.45％，早初級卵泡(1級)占25.51±6.01％，初級卵泡(2級)占3.43±1.87％，而轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡(3-4級)占4.17±1.36％；絕大部分未啟動發(fā)育的始基卵泡主要分布在卵巢表面的皮質(zhì)區(qū)，而較大的轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡位于皮質(zhì)深部，靠近卵巢中心部分的髓質(zhì)區(qū)，所有新生4天新鮮大鼠卵巢切片中未觀察到竇卵泡。 與新鮮大鼠卵巢不同的是，在無血清培養(yǎng)液中

9、體外培養(yǎng)14天后的卵巢切片中，可觀察到的健康卵泡總數(shù)：基礎(chǔ)培養(yǎng)組141±23.25個/片，VIP組116±36.57個/片，KL組為143±40.62個/片，與新鮮未培養(yǎng)組(139±32.32個/片)之間未出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。進(jìn)一步進(jìn)行分級卵泡分析顯示，新鮮卵巢組始基卵泡比例為66.87±7.45％，與之相比較，基礎(chǔ)培養(yǎng)組卵巢中始基卵泡比例明顯減少至54.75±10.97％，伴隨早初級卵泡比例較的明顯升高(54.31±8.52％ V

10、S36.85±11.01％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；初級卵泡、轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡的比例與新鮮卵巢相比較未顯示出有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。 2.VIP對始基卵泡啟動生長發(fā)育的影響 在卵巢基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加VIP(10-7M)、KL(50ng/ml)，以無額外添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)組為陰性對照，完全相同條件下培養(yǎng)14天后組織病理學(xué)觀察顯示：與基礎(chǔ)培養(yǎng)組相比較，VIP組、KL組切片上卵巢表面皮質(zhì)區(qū)的始基卵泡明顯減少，同時該區(qū)域的生長卵泡增加；

11、經(jīng)分級卵泡計數(shù)，KL組平均每張切片上始基卵泡比例為34.02±5.44％，VIP組始基卵泡比例下降到36.82±4.69％，伴隨著生長卵泡比例的上升(KL組65.97±5.44％、VIP組63.17±4.69％)，各組間靜息/生長卵泡比例經(jīng)統(tǒng)計分析顯示：與基礎(chǔ)培養(yǎng)組相比較，VIP、KL組始基卵泡比例降低、生長卵泡比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；進(jìn)一步的生長卵泡分類分析顯示，早初級卵泡比例的升高有統(tǒng)計學(xué)意義，p<0.01。與KL組不同的是，在

12、VIP組還觀察到接近皮質(zhì)表面轉(zhuǎn)化卵泡生成，3-4級(轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡)比例升高，5.25±3.06％ VS3.48±1.27％，但差異未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義，p=0.151。 3.PCNA免疫組織化學(xué)染色評價卵泡生長 未經(jīng)培養(yǎng)的新鮮卵巢切片中，始基卵泡基本不著色，但觀察發(fā)現(xiàn)有個別始基卵泡的卵母細(xì)胞著色；從早初級卵泡開始，生長卵泡中的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)PCNA陽性著色，在各級卵泡中，初級卵泡才開始出現(xiàn)明顯的卵母細(xì)胞著色。陰性對照組

13、未觀察到陽性著色。與新鮮對照組相似，基礎(chǔ)培養(yǎng)組、VIP組培養(yǎng)14天后進(jìn)行免疫組化染色后顯示早初級卵泡已出現(xiàn)PCNA著色，主要在卵母細(xì)胞，雖然在扁平梭形的前顆粒尚未見著色，但卵母細(xì)胞周圍的柱狀顆粒細(xì)胞開始顯示陽性，其他各級生長卵泡的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞均顯示陽性。與健康正常的各級生長卵泡的強(qiáng)PCNA著色不同，在閉鎖卵泡，卵母細(xì)胞的PCNA著色減弱，同時，顆粒細(xì)胞的著色開始減少、缺失非常顯著。在新鮮未培養(yǎng)組，只有34.17±5.02％的卵泡中

14、至少有一個顆粒細(xì)胞顯示PCNA陽性；經(jīng)14天體外培養(yǎng)后，基礎(chǔ)培養(yǎng)組、VIP組中分別有30.78±8.07％、48.53±5.45％的卵泡中出現(xiàn)著色顆粒細(xì)胞。統(tǒng)計分析顯示，新鮮組與基礎(chǔ)培養(yǎng)組之間PCNA陽性卵泡比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，p=0.484；而VIP組PCNA陽性卵泡比例高于新鮮組及基礎(chǔ)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，p<0.001。 4.VIP對KL mRNA表達(dá)的影響 新生4天大鼠18只，按配對設(shè)計，用實時定量RT—P

15、CR分析不同培養(yǎng)條件下卵巢KL mRNA表達(dá)量，在VIP培養(yǎng)組較對照組升高，1.73+1.042 VS0.76±0.46，經(jīng)配對樣本t檢驗，p=0.039，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 5.VIP對雌激素、雄烯二酮分泌水平的影響 組織培養(yǎng)過程中，每隔1天更換一次培養(yǎng)液，收集并低溫保存，培養(yǎng)結(jié)束后，將VIP組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組收集的培養(yǎng)液每二孔合并成一個測量單位，應(yīng)用ELISA檢測雄烯二酮、雌二醇水平。培養(yǎng)液中可檢測到雌二醇、雄烯二酮的分