骨形態(tài)發(fā)生蛋白—4對(duì)人卵巢組織玻璃化冷凍卵泡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由于惡性腫瘤發(fā)病率增加，近年來(lái)采用了大劑量的放、化療或聯(lián)合治療惡性腫瘤，使大多數(shù)患惡性腫瘤的兒童的生存期大大延長(zhǎng)，但是大劑量放化療后的嚴(yán)重副作用之一是對(duì)女性患者生殖功能的嚴(yán)重或全部損壞，導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)、卵巢早衰，甚至喪失生殖能力。另一方面，越來(lái)越多的女性由于職業(yè)競(jìng)爭(zhēng)壓力的增大而一再推遲生育年齡，給優(yōu)生優(yōu)育帶來(lái)了隱患。如何充分利用生殖資源保存女性特別是接受抗癌治療患者的生育能力，解除職業(yè)女性的后顧之憂成為近年來(lái)生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

2、目前，保存卵巢生殖功能的方法有以下幾種：冷凍卵母細(xì)胞、卵巢手術(shù)移位、藥物保護(hù)卵巢功能以及冷凍卵巢皮質(zhì)。相對(duì)于前幾種方法而言，卵巢組織冷凍是一種較為理想的大量保存原始卵泡的方法，因?yàn)樵悸雅莸脑S多特征使其不易受到冷凍損傷，比胚胎和卵子冷凍保存更具潛力，適于青春期前、青春期和育齡期的女性，不依賴于年齡和月經(jīng)周期，不需要卵巢刺激延遲抗癌治療。有報(bào)道通過卵巢組織片慢速冷凍-解凍后自體移植不僅恢復(fù)了自然月經(jīng)，并通過IVM-ET成功受孕與分娩，卵巢

3、組織的冷凍保存可能成為女性較為可靠的卵巢功能保存的方法。 以往的卵巢組織冷凍研究以慢速冷凍-快速?gòu)?fù)溫法為主，但是卵巢組織中含有多種類型的細(xì)胞，對(duì)冷凍平衡的要求各不相同，因此導(dǎo)致慢速冷凍法對(duì)卵巢組織損傷較大，效果差。玻璃化冷凍技術(shù)是將卵巢組織片放置在較高濃度的冷凍保護(hù)劑中平衡一段時(shí)間后直接投入-196℃的液氮中快速降溫，使卵巢組織在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法形成冰晶而直接形成“玻璃樣”固態(tài)，相對(duì)于慢速冷凍而言是一種操作簡(jiǎn)單、儀器設(shè)備要求較低、較

4、有前途的冷凍方法，玻璃化冷凍較早應(yīng)用于人類胚胎、囊胚和卵母細(xì)胞的冷凍保存，獲得較好的冷凍保存效果且均已獲得活產(chǎn)。因此，玻璃化冷凍技術(shù)日益受到重視，成為卵巢功能保存研究的新熱點(diǎn)。本研究欲采用此方法行卵巢組織的冷凍保存，并通過體外培養(yǎng)評(píng)估冷凍－解凍后卵巢組織的活力保存情況。 在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中有幾個(gè)主要步驟，包括原始卵泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化，初級(jí)卵泡向次級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化、選擇和閉鎖，其中兩次轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是卵泡生長(zhǎng)過程中的限速步驟。目前對(duì)人原始卵

5、泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制還不清楚。近年來(lái)，人們?cè)谔剿髟悸雅菹虺跫?jí)卵泡轉(zhuǎn)化機(jī)制及降低卵泡體外培養(yǎng)中卵泡閉鎖率的過程中將目光轉(zhuǎn)向生長(zhǎng)因子，有研究表明轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子超家族中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）家族參與了這一過程。BMPs是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族中最大的一個(gè)家族，至今有約15種BMP被報(bào)道。其中BMP-4最初命名是由于其在骨和軟骨代謝中的作用，在哺乳動(dòng)物卵巢中的功能首先由Shimasaki等在1999年報(bào)道。目前認(rèn)為BM

6、P-4在小鼠卵巢中的表達(dá)部位是竇前卵泡的卵泡膜細(xì)胞，而其受體是在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中表達(dá)，通過自分泌/旁分泌方式調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、存活和內(nèi)分泌變化。 有研究顯示，在新生小鼠卵巢的體外培養(yǎng)過程中，加入重組人BMP-4可以顯著促進(jìn)原始卵泡向初級(jí)卵泡的轉(zhuǎn)化，同時(shí)降低卵泡的凋亡率。另有實(shí)驗(yàn)表明重組人BMP-4可以調(diào)節(jié)FSH的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)雌二醇的產(chǎn)生，同時(shí)抑制孕激素的生物合成，被稱為“黃體化抑制劑”。根據(jù)對(duì)羊的研究提示，BMP-4

7、不僅可以抑制FSH誘導(dǎo)的孕激素合成，而且能抑制無(wú)FSH時(shí)的基礎(chǔ)孕激素合成，說(shuō)明BMP-4在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育和存活方面可能發(fā)揮重要作用。目前尚未見到BMP-4在人卵巢組織玻璃化冷凍-解凍后體外培養(yǎng)中對(duì)卵泡作用的相關(guān)報(bào)道。 目的: 本實(shí)驗(yàn)將玻璃化冷凍后人卵巢組織行體外培養(yǎng)，評(píng)估冷凍后人卵巢組織的活力；同時(shí)在培養(yǎng)過程中加入重組人BMP-4，探討其在玻璃化冷凍后人卵泡的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和存活方面的作用，分析其對(duì)卵泡分泌活動(dòng)的影響，同時(shí)探討

8、BMP-4對(duì)卵泡雌孕激素分泌活動(dòng)影響的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究卵泡牛長(zhǎng)轉(zhuǎn)化機(jī)制和卵巢組織冷凍保存及卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法: 1．組織來(lái)源 選取廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2008年4月至11月進(jìn)行卵巢手術(shù)的女性患者32例作為研究對(duì)象，患者年齡29．66±4．25歲（16～37歲），有規(guī)律月經(jīng)、無(wú)內(nèi)分泌紊亂、無(wú)放化療史、半年內(nèi)無(wú)激素服用史且卵巢囊腫直徑<7cm。

9、 2．實(shí)驗(yàn)方法 2．1卵巢組織冷凍及培養(yǎng)：將在開腹手術(shù)或腹腔鏡下獲得的卵巢組織標(biāo)本立即放置在室溫保存的HEPES-MEM培養(yǎng)液中，30分鐘內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，在室溫下用HEPES-MEM培養(yǎng)液沖洗兩次后，移入裝有該液體的培養(yǎng)皿中。修剪卵巢組織并切除卵巢髓質(zhì)，然后將卵巢皮質(zhì)切成2mm×2mm×1mm的皮質(zhì)片，將來(lái)自同一患者的皮質(zhì)片隨機(jī)分為新鮮卵巢組織（A組）、玻璃化冷凍復(fù)溫后卵巢組織：未培養(yǎng)組（B組）、基本培養(yǎng)液培養(yǎng)組（C組）和BMP

10、-4培養(yǎng)液組（D組），基本培養(yǎng)液組和BMP-4培養(yǎng)液組于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，每隔兩天更換400μl培養(yǎng)液，更換過的培養(yǎng)液收集到EP管中于-20℃保存，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行雌孕激素測(cè)定。 2．2組織學(xué)檢查：將新鮮卵巢組織和玻璃化冷凍后未培養(yǎng)組，基本培養(yǎng)液及BMP-4培養(yǎng)液組分別體外培養(yǎng)15天后的卵巢組織行組織學(xué)檢查，切片厚度5μm，間隔50μm將切片行HE染色閱片，計(jì)數(shù)其中原始卵泡、初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡，計(jì)算四組原始卵泡

11、和生長(zhǎng)卵泡（包括初級(jí)和次級(jí)卵泡）所占百分比，以及冷凍前后形態(tài)正常的原始卵泡和初級(jí)卵泡百分率。 2．3雌孕激素測(cè)定：所有組織培養(yǎng)結(jié)束后，將貯存的裝有更換過培養(yǎng)液的EP管于室溫下解凍，并將每一標(biāo)本的培養(yǎng)液集中于測(cè)定管中，用ADVIA Centaur自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行培養(yǎng)液中雌孕激素測(cè)定。 結(jié)果: 1．冷凍對(duì)卵巢組織中各級(jí)卵泡比例的影響:冷凍后的卵巢組織與新鮮組比較，原始卵泡、生長(zhǎng)期卵泡（初級(jí)卵泡以及次級(jí)卵泡）

12、占總卵泡的比例差異均無(wú)顯著性（P>0．05）。 2．冷凍對(duì)卵巢組織中各級(jí)卵泡的形態(tài)影響:玻璃化冷凍后形態(tài)正常的原始卵泡及初級(jí)卵泡百分率，與新鮮卵巢組相比均無(wú)明顯差異。 3．BMP-4對(duì)冷凍后卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的影響:玻璃化冷凍卵巢組織解凍后培養(yǎng)15天，培養(yǎng)結(jié)束后基本培養(yǎng)液組（C組）和BMP-4組（D組）平均有53．29±18．26％和43．38±22．59％的卵泡處于原始卵泡階段，顯著低于未培養(yǎng)組的原始卵泡所占比例84．63±

13、8．01％，而C和D組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 基本培養(yǎng)液組和BMP-4組平均有46．71±18．26％和56．62±22．59％的卵泡是生長(zhǎng)期卵泡，兩組之間差異無(wú)顯著性，但明顯高于未培養(yǎng)組的生長(zhǎng)卵泡所占比例15．37±8．01％。 4．BMP-4對(duì)基礎(chǔ)雌孕激素分泌的影響:培養(yǎng)結(jié)束后，基本培養(yǎng)液組和BMP-4組中雌二醇的含量分別是1011．13±321．50ng/L和1186．17±405．78ng/L，BMP-4組雌激素含量

14、稍增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；基本培養(yǎng)液組和BMP-4組孕激素的含量分別是7．02±3．09ug/L和4．61±2．69ug/L，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1．冷凍保存人類卵巢組織，可以保存大量的原始卵泡和較多的初級(jí)卵泡。 2．玻璃化冷凍可以較好的保存人類卵巢組織中原始和初級(jí)卵泡的形態(tài)，對(duì)卵泡體外生長(zhǎng)影響較小，操作簡(jiǎn)便，是人類卵巢組織較適宜的冷凍保存方法。 3．BMP-4有助于冷凍后人類卵巢組織體外培養(yǎng)中原始卵泡