2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩115頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、腦缺血性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)常見病癥,常導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,嚴(yán)重影響人類的健康和生命,是當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)迫切需要解決的問題。腦組織缺血后再灌注過程是腦缺血性疾病常見的病理變化。研究表明,腦缺血再灌注期間發(fā)生復(fù)雜的病理、生理變化。一方面,腦缺血再灌注可挽救瀕臨死亡的細(xì)胞,另一方面則可加重細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此,如何減少腦缺血再灌注損傷是治療腦缺血性疾病過程中急需解決的關(guān)鍵問題。白藜蘆醇是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的多酚類化合物。近年來關(guān)于白藜

2、蘆醇神經(jīng)保護(hù)性作用的研究已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域里的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究分別采用體內(nèi)、體外兩種腦缺血再灌注模型,進(jìn)一步探討了白藜蘆醇對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,并且分別從蛋白、基因水平研究了白藜蘆醇與腦缺血再灌注損傷發(fā)生密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9的關(guān)系。旨在進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用白藜蘆醇治療腦缺血性疾病奠定理論基礎(chǔ)。 一、建立小鼠大腦中動(dòng)脈暫時(shí)性腦缺血模型目的建立穩(wěn)定的、可重復(fù)性的局灶性

3、腦缺血再灌注動(dòng)物模型,為腦缺血性疾病的治療研究奠定基礎(chǔ)。方法選用成年雄性Balb/c小鼠,采用插線法建立暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈栓塞(Middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型。MCAO時(shí)間分別為30min、60min、90min和120min。于手術(shù)后24h分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。腦組織切片行HE染色,光鏡觀察缺血區(qū)域及其周圍細(xì)胞形態(tài)特征。并獲取完整端腦,切成2mm冠狀厚片,2%紅四氮唑(TTC)染色,

4、計(jì)算梗塞體積并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果MCAO30min和60min僅引起小鼠輕微的神經(jīng)功能障礙,而MCAO90min及120min可引起小鼠明顯的神經(jīng)功能障礙。相比較而言,MCAO120min組神經(jīng)功能評(píng)分最高,且變化最小。腦切片HE染色,于缺血半影區(qū)可見神經(jīng)元出現(xiàn)缺血性改變,胞漿空泡形成,核固縮、核周體消失等,但仍有部分正常的神經(jīng)元存在。腦梗死區(qū)見神經(jīng)元損害進(jìn)一步加重,核固縮更為明顯,胞漿空泡進(jìn)一步增大,細(xì)胞間隙加寬更為明顯及細(xì)胞核完全

5、消失的神經(jīng)元壞死改變。TTC染色顯示,暫時(shí)性MCAO30min至60min未能形成明顯的、恒定的梗死灶,而暫時(shí)性MCAO90min和120min小鼠腦切面可見明顯的蒼白色梗塞區(qū)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,MCAO120min可引起該側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域廣泛的梗死灶,而且梗塞灶大小適宜,穩(wěn)定性好。結(jié)論插線法是一種簡單、可靠的制作小鼠暫時(shí)性MCAO模型的方法,MCAO120min再灌注22h可引起穩(wěn)定的梗塞灶,適合于腦缺血再灌注損傷的對(duì)照研究。

6、 二、白藜蘆醇對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用目的證實(shí)白藜蘆醇對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,進(jìn)一步探討其與缺血腦組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase9,MMP-9)及MMP-2的關(guān)系。方法以上述小鼠MCAO120min再灌注22h模型作為對(duì)照研究對(duì)象。白藜蘆醇溶于20%環(huán)糊精/0.9%NaCL,50mg/kg強(qiáng)飼,每天1次,于第7d行MCAO。MCAO2h再灌注22h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,并獲

7、取完整端腦,切成2mm冠狀厚片,2%紅四氮唑(TTC)染色,計(jì)算腦梗死灶的大小并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外,分別于MCAO2h再灌注4h、10h及22h取患側(cè)或?qū)φ諅?cè)端腦,提取總蛋白或總RNA,分別采用WesternBlot、明膠酶譜分析、RT-PCR及NorthernBlot分別從蛋白和基因水平檢測MMP-9和MMP-2的表達(dá)。結(jié)果與MCAO120min再灌注22h模型對(duì)照比較,白藜蘆醇治療可明顯提高小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分(p<0.05),而且

8、,與此相對(duì)應(yīng),治療組梗死灶明顯小于對(duì)照組(p<0.01,白藜蘆醇治療組V=39.8±7.5mm3;對(duì)照組V=69.7±5.9mm3)。WesternBlot和明膠酶譜分析結(jié)果證明,白藜蘆醇可降低腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的MMP-9的蛋白表達(dá)水平及活性。RT-PCR及NorthernBlot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),白藜蘆醇可在mRNA水平發(fā)揮其對(duì)MMP-9的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。RT-PCR和明膠酶譜分析證實(shí),MMP-2的表達(dá)量于腦缺血再灌注早期(24h內(nèi))

9、未發(fā)生明顯變化。結(jié)論白藜蘆醇對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用,這可能得益于其抑制了MMP-9的高表達(dá)。MMP-2可能于腦缺血再灌注損傷早期的病理變化無關(guān)。 三、建立氧糖剝奪離體神經(jīng)元缺血再灌注模型目的原代培養(yǎng)獲得純化的小鼠皮層神經(jīng)元,在細(xì)胞水平建立一種可靠的、簡便易行的氧糖剝奪離體神經(jīng)元缺血再灌注模型,為研究神經(jīng)元缺血性損傷機(jī)制及進(jìn)行藥物篩選奠定必備基礎(chǔ)。方法選擇14~15dBalb/c胎鼠作為大腦皮層神經(jīng)元的來源

10、。采用酶消化法獲得腦皮層神經(jīng)元,首先在含10%FBS的DMEM中,于37℃,5%CO2孵箱中體外培養(yǎng),24h后換為含有神經(jīng)元培養(yǎng)添加劑B27(2%)的DMEM繼續(xù)培養(yǎng),以促進(jìn)神經(jīng)元的分化及抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。10d時(shí)采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行NF200染色,鑒定神經(jīng)元的純度。體外培養(yǎng)10d左右即可用于氧糖剝奪試驗(yàn)。氧糖剝奪的時(shí)間分別為2h、3h、4h、5h。于開始試驗(yàn)后24h,采用臺(tái)盼藍(lán)檢測細(xì)胞存活率,通過檢測培

11、養(yǎng)液中LDH的漏出率評(píng)估細(xì)胞膜通透性改變即損傷程度,從病理生理學(xué)角度闡明神經(jīng)元機(jī)損傷的效果。結(jié)果神經(jīng)元體外培養(yǎng)10d,光鏡下可見成熟神經(jīng)元特征,如細(xì)胞核大而清晰、透亮,圓形或卵圓形,核仁明顯,核膜清晰可見,胞體呈多形性,胞質(zhì)透亮,細(xì)胞具有折光性,自胞體伸出較多突起,神經(jīng)元突起間相互聯(lián)系,形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。NF200免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞陽性率達(dá)90%。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示,暫時(shí)性氧糖剝奪2h、3h、4h及5h、均可引起不同程度的神經(jīng)元死亡

12、。其中,氧糖剝奪4h“再灌注”20h組對(duì)神經(jīng)元活力的影響適中,且穩(wěn)定性較好。LDH漏出率結(jié)果與臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果相一致。結(jié)論采用酶消化法可分離獲得小鼠大腦皮層神經(jīng)元,而且B27不但可誘導(dǎo)神經(jīng)元體外分化,又可有效抑制膠質(zhì)細(xì)胞的增生。氧糖剝奪4h復(fù)糖、復(fù)氧20h可引起明顯的神經(jīng)元損傷,死亡率達(dá)50%,且較穩(wěn)定,適宜作為腦缺血再灌注損傷的體外研究對(duì)照模型。 四、白藜蘆醇對(duì)暫時(shí)性氧糖剝奪致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用目的在體外驗(yàn)證白藜蘆醇對(duì)暫時(shí)性氧

13、糖剝奪致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用,進(jìn)一步在細(xì)胞水平探討白藜蘆醇對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制,即其對(duì)原代皮層神經(jīng)元MMP-9表達(dá)的影響。方法以小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元氧糖剝奪4h“再灌注”20h模型為研究對(duì)照。白藜蘆醇溶于DMSO,儲(chǔ)液濃度為0.1M。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入培養(yǎng)基,終濃度分別為10μM、25μM、50μM、100μM,治療時(shí)間從缺氧開始,直至試驗(yàn)結(jié)束。臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。提取培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白,采用免疫印跡法分析MMP-9蛋白表達(dá)。

14、提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA,采用RT-PCR檢測MMP-9mRNA水平。結(jié)果臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示,OGD4h再灌注20h可引起約50%神經(jīng)元死亡,0.1%DMSO并沒有加重神經(jīng)元的損害。而白藜蘆醇干預(yù)治療確實(shí)可減少這種條件下神經(jīng)元的死亡,但這種保護(hù)作用具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。這些結(jié)果表明,50μM和100μM白藜蘆醇對(duì)于離體神經(jīng)元缺血再灌注損傷具有良好保護(hù)作用,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。免疫印跡結(jié)果顯示,正常神經(jīng)元MMP-9蛋白的表達(dá)水平很低,OG

15、D4h再灌注20h可顯著提高神經(jīng)元MMP-9蛋白的表達(dá)。然而,這種增高的MMP-9蛋白表達(dá)水平可被白藜蘆醇干預(yù)治療所抑制。50和100μM兩種濃度降低MMP-9蛋白的表達(dá)的效果最為明顯(p<0.01)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,正常體外培養(yǎng)神經(jīng)元幾乎沒有檢測到MMP-9mRNA,OGD4h再灌注20h組神經(jīng)元檢測到高水平的MMP-9mRNA。治療組中,隨白藜蘆醇的濃度增加,MMP-9mRNA的水平逐漸降低。與損傷組比較,50和100μ

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論