黃連素調(diào)節(jié)人源alpha6型尼古丁受體及機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的：神經(jīng)元型尼古丁乙酰膽堿受體（nAChRs）在調(diào)節(jié)大腦的功能中扮演著許多重要的角色。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)nAChRs除介導(dǎo)尼古丁成癮外還與多種神經(jīng)和精神系統(tǒng)疾病有關(guān)。nAChRs由多種不同的α或α和β亞單位組成，分布在神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位，具有不同的功能作用和藥理學(xué)特性。含有α6亞單位的尼古丁乙酰膽堿受體（α6*-nAChRs）是其中的一類非常重要的受體，雖然在大腦中分布并不廣泛，但其主要集中在中腦多巴胺能神經(jīng)元所分布的區(qū)域，而這一區(qū)域

2、與人的愉悅，獎賞和情緒控制，尤其是與藥物成癮有關(guān)，又稱獎賞中樞。因此推測α6*-nAChRs可能參與調(diào)節(jié)中腦多巴胺環(huán)路相關(guān)的生理和和病理生理以及參與藥物的獎賞和成癮。然而，人們迄今對α6*-nAChRs的功能，藥理和調(diào)節(jié)認(rèn)知甚少，主要原因是目前尚無α6*-nAChR的選擇性激動劑，且人為轉(zhuǎn)染α6和其它β亞單位至細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不能很好地形成具有功能的α6*-nAChRs?，F(xiàn)在，美國Barrow Neurological Institute的

3、Dr.Whiteaker lab已經(jīng)成功地將功能性α6*-nAChRs轉(zhuǎn)入人源SH-EP1細(xì)胞系，而且可以確定異源性表達(dá)功能性α6*-nAChRs的SH-EP1細(xì)胞系是研究α6*-nAChRs良好的細(xì)胞模型。黃連素是從黃連根中提取的一種天然的異喹啉類生物堿，又名鹽酸小檗堿。它是中國傳統(tǒng)的一味中藥，具有良好的抗菌作用，主要用于治療腸道細(xì)菌感染。但是，新近的證據(jù)表明黃連素可能還具有其他的一些新作用，包括治療心律失常、糖尿病、高血脂和癌癥。但

4、是黃連素是否能影響尼古丁受體，是否能用于控制藥物成癮，尤其是吸煙導(dǎo)致的尼古丁成癮，仍不清楚。本課題致力于研究黃連素對人源α6*-nAChRs的影響，以闡明黃連素的新作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)新型的戒煙藥物提供實驗證據(jù)。
　　方法：
　　實驗對象
　　1）轉(zhuǎn)染的人源尼古丁受體：將α6(N-terminal)+α3(transmembrane domain)+β2β3(α6N/α3Cβ2β3 nAChRs,簡寫為α6*-n

5、AChR)轉(zhuǎn)入人源上皮腫瘤細(xì)胞系（SH-EP1）中使α6*-nAChRs穩(wěn)定表達(dá)于培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞膜上用于膜片鉗記錄。
　　2）爪蛙卵細(xì)胞：α6(N-terminal)+α3(transmembrane domain and C-terminal)+β2β3或α6全段(N-terminal+transmembrane domain)擁有一個點突變+β2β3的DNA微注射入蛙卵細(xì)胞以表達(dá)功能性α6*-nAChRs用于雙電極電壓鉗記錄。<

6、br>　　3）C57BL/J6小鼠:成年雄性小鼠用于撿測黃連素對尼古丁引起的位置偏好反應(yīng)。
　　膜片鉗全細(xì)胞記錄
　　在鉗制電壓為-40mV的條件下記錄尼古丁引起α6*-nAChR所介導(dǎo)的全細(xì)胞內(nèi)向電流反應(yīng)，然后撿測黃連素對該電流反應(yīng)的影響。
　　雙電極電壓鉗技術(shù)
　　為了進(jìn)一步研究藥物作用位點，我們將突變體α6*-nAChRs導(dǎo)入蛙卵細(xì)胞，作為另一種細(xì)胞模型。在這個實驗中我們使用雙電極電壓鉗技術(shù)，將表達(dá)α6*-

7、nAChRs的蛙卵細(xì)胞用Axoclamp900A放大器把電壓維持在-70mV。藥物溶于卵母細(xì)胞緩沖液通過16通道自重力灌流系統(tǒng)，通過自動閥門控制。
　　藥物通過計算機(jī)控制的U型管給藥系統(tǒng)，可將藥物快速灌流到細(xì)胞表面（～30ms）。胞內(nèi)給藥是將黃連素溶于電極內(nèi)液中，當(dāng)形成全細(xì)胞封接狀態(tài)時，等待至少20分鐘，以保證電極內(nèi)液和和細(xì)胞內(nèi)液進(jìn)行充分對流交換，確保黃連素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
　　條件性位置偏愛實驗（Conditioned pla

8、ce preference,CPP）
　　分為三組：（1）生理鹽水+尼古丁為陽性對照組，（2）黃連素+尼古丁為實驗組，（3）黃連素+生理鹽水為黃連素對照組。黃連素給藥方式為灌胃，劑量為20mg/kg。尼古丁為腹腔注射，計量是0.5mg/kg。生理鹽水在（1）組為灌胃方式，容量同實驗組的黃連素。生理鹽水在（3）組為腹腔注射，容量同陽性對照組（2）的尼古丁。動物預(yù)適應(yīng)3天，注射4天（每日二次），然后撿測CPP。
　　數(shù)據(jù)的處理,

9、分析和統(tǒng)計學(xué)
　　使用Clampfit10.6、Excel、Origin8、GraphPad Prism7這些軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的離線分析。兩組數(shù)據(jù)間比較用t-test，兩組以上數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。
　　結(jié)果與結(jié)論：
　　1）轉(zhuǎn)入α6*-nAChRs的SH-EP1細(xì)胞系，可以作為研究黃連素對α6*-nAChRs藥理學(xué)特性的模型細(xì)胞。
　　2）尼古丁可以激活α6*-nAChRs產(chǎn)生全

10、細(xì)胞電流，該反應(yīng)可以被黃連素抑制，而且具有濃度依賴性。
　　3）黃連素抑制α6*-nAChRs的藥理學(xué)機(jī)制是一種非競爭型抑制，實驗證明黃連素對α6*-nAChR的抑制在高濃度和低濃度尼古丁引起的反應(yīng)是相似的。
　　4）胞內(nèi)給予GDP-βS（600μM）以阻斷受體的內(nèi)化，但不能抑制黃連素引起的抑制作用，說明此抑制作用不是由于α6*-nAChRs內(nèi)化所致。
　　5）黃連素對α6*-nAChRs的突變體（含有全α6的結(jié)構(gòu)但擁

11、有一個突變點）的抑制作用與SH-EP1細(xì)胞α6/α3的嫁接體α6*-nAChRs的抑制類似，這說明黃連素的作用位點可能是在α6*-nAChRs（N端）而不在α3-nAChRs的跨膜區(qū)上。
　　6）條件性位置偏愛實驗顯示實驗組的黃連素可以減輕由尼古丁引起的小鼠條件性位置偏愛作用。
　　綜上所述，本課題利用多種實驗技術(shù)在不同水平的細(xì)胞和動物模型首次闡明了黃連素對α6*-nAChRs的拮抗作用及其作用機(jī)制。這一新發(fā)現(xiàn)將對理解黃連素