預后營養(yǎng)指數(shù)對惡性胸膜間皮瘤預后的影響及黃連素誘導其凋亡、自噬的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)是一種惡性程度高、較為罕見的腫瘤，環(huán)境的石棉暴露是主要的致病因素。雖然近些年來石棉的使用量在世界范圍內減少，但是由于其潛伏期長（約20-40年），本病的發(fā)病率仍在持續(xù)上升。MPM預后不良，其確診后中位生存期約12個月，關于MPM的預后分析，國內缺乏大宗的病例報道，數(shù)據(jù)主要來源于國外。因此，本課題在第一部分首先回顧性分析了121例病

2、理確診為MPM的患者的臨床病理特征并對其隨訪資料進行生存分析，研究治療前預后營養(yǎng)指數(shù)(prognostic nutritional index，PNI)與患者臨床病理特點、預后的相關性，探討PNI在判定MPM預后中的作用和臨床意義。
　　MPM的治療方法主要有手術治療、化學治療、放射治療以及三峰治療等方法，但是效果均不理想，盡管目前培美曲塞聯(lián)合應用鉑類制劑的一線化療方案或三峰治療取得了一定的臨床效果，可以改善患者的生存率，但是仍然

3、缺乏理想的療效，且化療毒副作用較大，目前仍無統(tǒng)一的治療方法。因此亟需尋找新型有效且毒副作用低的治療方法。
　　黃連素是一種從黃連、三顆針、黃柏等植物中提取出來的異喹啉生物堿，它具有廣泛的藥理學作用。近年來，有研究表明其具有顯著的抗腫瘤作用，已經在肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌等腫瘤中得到證實。黃連素主要是通過抑制腫瘤細胞增殖，調控細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤侵襲轉移等方式來發(fā)揮作用。另外，近來有報道，黃連素可以通過誘導

4、細胞自噬發(fā)揮抗腫瘤的作用。但是目前仍未有黃連素在間皮瘤治療中的報道。因此本課題的第二部分應用體外實驗研究黃連素對人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞的作用，并進一步探討凋亡和自噬在黃連素治療間皮瘤過程中的作用及相關分子機制。
　　第一部分:預后營養(yǎng)指數(shù)與惡性胸膜間皮瘤預后的相關性研究
　　目的:
　　本部分研究通過對121例MPM患者的臨床病理特點及隨訪資料進行生存分析，研究治療前PNI與患者的臨床病理特點、預后的相關性

5、，探討PNI在判定MPM預后中的作用和臨床意義。
　　方法:
　　2001年10月-2013年1月間于山東省立醫(yī)院呼吸科、齊魯醫(yī)院呼吸科、山東省胸科醫(yī)院結核科行內科胸腔鏡檢查病理診斷為MPM的患者121例，收集患者的臨床病理及實驗室資料，并對患者進行隨訪，收集隨訪資料。PNI計算公式為:10×血清白蛋白值(g/dl)+0.005×外周血淋巴細胞計數(shù)（/mm3）。應用單因素及多因素生存分析，檢測PNI及各項臨床病理參數(shù)對預后的

6、影響。
　　結果:
　　1.全組患者平均PNI值為44.6±6.3，PNI與年齡、吸煙史及體重減輕明顯相關(P＜0.05)。
　　2.本研究將PNI的平均值44.6作為界值將全組患者分為兩組:低PNI組(PNI＜44.6;n=60;49.6％)及高PNI組(PNI≥44.6;n=61;50.4％)。截止到最后隨訪時間，121例患者中，有77例(66.3％)死亡，其中高PNI組31例，低PNI組46例。全組患者的中位累積

7、生存時間為15個月（0.386個月）。低PNI患者中位累積生存時間為11個月，明顯短于高PNI患者的18個月，低PNI患者的1年及2年總生存率分別低于高PNI患者的1年總生存率(45.5％VS72.3％)及2年總生存率（18.4％VS38.7％;Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗P=0.003）。
　　3.低PNI患者較高PNI患者有更高的死亡風險(HR[hazard ratio]:2.290;95％CI[confi

8、dence interval]:1.415-3.706;P=0.001)。
　　結論:
　　PNI是判定MPM總生存率的獨立預后因素，低PNI患者較高PNI患者有更高的死亡風險。
　　第二部分:黃連素誘導人胸膜間皮瘤細胞凋亡與自噬及分子機制研究
　　目的:
　　研究黃連素對人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞的作用，并進一步探討凋亡和自噬在黃連素治療間皮瘤過程中的作用及相關分子機制。
　　方法:

9、　　一、黃連素誘導人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞凋亡作用的研究
　　不同濃度黃連素干預人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞系，應用MTT法檢測細胞的增殖活性;應用Hoechst33258染色及AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡;應用western blot分析黃連素誘導NCI-H2452細胞凋亡的分子機制。
　　二、黃連素誘導人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞自噬作用的研究
　　黃連素作用于人胸膜間

10、皮瘤NCI-H2452細胞系，應用免疫熒光法檢測細胞內自噬特異性標記物LC3的分布;應用western blot探討黃連素誘導NCI-H2452細胞自噬相關蛋白的表達以及自噬抑制劑及自噬激動劑對黃連素誘導的自噬的影響。
　　三、自噬在黃連素誘導人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞死亡過程中的作用
　　應用MTT法檢測自噬抑制劑3-MA抑制自噬后對黃連素引起的NCI-H2452細胞增殖抑制的影響;用凋亡抑制劑、自噬抑制劑、自噬激

11、動劑分別聯(lián)合黃連素干預間皮瘤細胞，然后應用臺盼藍染色法探討黃連素誘導的間皮瘤細胞死亡過程中凋亡與自噬的作用;應用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法及western blot探討黃連素誘導間皮瘤NCIH2452細胞自噬與凋亡的關系。
　　結果:
　　一、黃連素誘導人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞凋亡作用的研究
　　1.黃連素可以顯著抑制NCI-H2452細胞增殖，呈劑量及時間依賴性。
　　2.Hoechst

12、33258染色及AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法結果顯示黃連素可以誘導細胞的凋亡，與對照組比較，當用100μM的黃連素干預細胞48小時后，凋亡率由對照組的4.55±0.96％顯著上升至34.23±1.16％（P＜0.001）。
　　3.Westernblot結果顯示黃連素可能是通過caspase-9介導的內源性線粒體途徑促進間皮瘤細胞凋亡。
　　二、黃連素誘導人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞自噬作用的研究
　

13、　1.LC3免疫熒光可見LC3的分布由未處理組的廣泛彌漫型分布變?yōu)辄S連素處理組的核周針尖樣、顆粒樣分布。
　　2.黃連素增加LC3(II)的表達，下調p62的表達，并呈時間劑量依賴性。
　　3.3-MA可以抑制而雷帕霉素可以增加黃連素誘導的自噬。
　　三、自噬在黃連素誘導人胸膜間皮瘤NCI-H2452細胞死亡過程中的作用
　　1.黃連素以劑量依賴性殺死細胞，當黃連素濃度達到200μM干預細胞48小時時，細胞死亡率

14、達到34.66±5.32％(P＜0.001)。
　　2.抑制凋亡降低黃連素誘導的細胞死亡率，z-VAD-fmk能夠顯著逆轉黃連素誘導的NCI-H2452細胞死亡，說明凋亡參與黃連素誘導的細胞死亡。
　　3.抑制自噬增加、誘導自噬降低黃連素誘導的NCI-H2452細胞死亡率。
　　4.抑制自噬增加黃連素誘導的NCI-H2452細胞凋亡。
　　結論:
　　1.黃連素可以誘導間皮瘤NCI-H2452細胞發(fā)生凋亡，

15、可能是通過caspase-9介導的內源性線粒體途徑促進間皮瘤細胞凋亡。
　　2.黃連素可以誘導間皮瘤NCI-H2452細胞發(fā)生自噬，下調p62蛋白表達。
　　3.凋亡是黃連素誘導的間皮瘤NCI-H2452細胞死亡的主要形式，自噬是一種應激反應，可能是通過阻止細胞凋亡而對細胞起到的一種保護作用，抑制自噬可以增加細胞凋亡，增強間皮瘤NCI-H2452細胞對黃連素的敏感性。
　　創(chuàng)新性和意義:
　　1.本課題首次發(fā)現(xiàn)P