黃連素對(duì)牙齦卟啉單胞菌的影響.pdf

1、背景：在牙周炎的發(fā)生和發(fā)展過程中，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)起著重要作用，它是慢性牙周炎的機(jī)會(huì)致病菌，也是齦下生物膜的重要組成部分。生物膜的主要成分有各種微生物細(xì)胞，胞外多糖，水及細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，而口腔細(xì)菌就常以生物膜的方式存在于口腔中，并進(jìn)一步發(fā)展成為菌斑，危害口腔健康。生物膜是一個(gè)動(dòng)態(tài)的環(huán)境，在其形成的過程中細(xì)菌呈現(xiàn)的狀態(tài)以及基因的表達(dá)都會(huì)是不同的。胞外多糖構(gòu)成了生物膜的骨架，如果抑制或者破壞

2、多糖的表達(dá)將會(huì)大大影響生物膜的穩(wěn)定性和完整性[1]。近年來，一些研究已經(jīng)表明黃連素可能抑制牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)，然而暫無任何研究闡述黃連素在P. g細(xì)菌莢膜及口腔生物膜的合成、抑制該細(xì)菌分裂增殖、等方面的分子生物學(xué)機(jī)制。P. g參與的齦下菌斑誘導(dǎo)牙齦的出血及感染，近來口腔種植體的逐步流行，術(shù)后出現(xiàn)種植體周圍炎的病例也有所增多，臨床用藥十分有限。隨著國(guó)際上對(duì)黃連素作為新型抗菌素研究的深入，本文希望通過研究黃連素作用于P. g的分子生物學(xué)機(jī)

3、制，探討黃連素作為一種新型的口腔牙周細(xì)菌生物膜抑制劑的可行性，從而達(dá)到預(yù)防和治療牙周病的效果。依據(jù)這一事實(shí)我們的長(zhǎng)期目標(biāo)將試圖闡述黃連素抑制牙齦齦卟單胞菌表達(dá)的分子生物學(xué)機(jī)制：黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)與細(xì)菌分裂蛋白ftsZ的組裝功能有關(guān)；黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌的莢膜多糖及細(xì)菌生物膜的表達(dá)和合成。
　　目的：⑴探究黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)的分子生物學(xué)機(jī)制。⑵黃連素對(duì)牙齦卟啉單胞菌參與的生物膜產(chǎn)生抑制作用，并揭示在藥物作用下

4、牙齦卟啉單胞菌的莢膜多糖的變化。
　　方法：通過測(cè)試牙齦卟啉單胞菌W83和ATCC33277在不同濃度的黃連素作用下的生長(zhǎng)曲線來確定黃連素是否對(duì)牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)有影響；通過斑點(diǎn)血平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高濃度的黃連素是否能夠殺滅牙齦卟啉單胞菌；在黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)曲線的基礎(chǔ)上，使用電鏡觀察及BactlightRed熒光染色檢測(cè)黃連素是否可以改變細(xì)菌的形態(tài)，并假設(shè)細(xì)菌形態(tài)的改變是因?yàn)辄S連素調(diào)控牙齦卟啉單胞菌的分裂蛋白ftsz基因

5、的表達(dá)量；通過拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)在黃連素作用下的牙齦卟啉單胞菌的表面形貌的變化；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)在不同濃度的黃連素作用不同的時(shí)間下編碼牙齦卟啉單胞菌分裂蛋白ftsz基因表達(dá)的變化；通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在不同濃度的黃連素作用下對(duì)牙齦卟啉單胞菌的莢膜多糖合成蛋白基因的影響；通過96孔聚氯乙烯板生物膜培養(yǎng)法，使用酶標(biāo)儀測(cè)得OD570值檢測(cè)黃連素作用下生物膜的表達(dá)。
　　結(jié)果：將生長(zhǎng)14小時(shí)的牙齦卟啉單胞菌用新鮮的TSB培

6、養(yǎng)基稀釋成OD600=0.2后，分別加入黃連素使黃連素的終濃度為0 mg/ml，0.01 mg/ml，0.05 mg/ml，0.1 mg/ml繼續(xù)生長(zhǎng)30小時(shí)后，繪出牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明在黃連素濃度為0.01 mg/ml，0.05 mg/ml，0.1 mg/ml時(shí)均抑制了牙齦卟啉單胞菌W83和ATCC33277的生長(zhǎng)；使用0 mg/ml，0.05 mg/ml，0.1 mg/ml，0.5 mg/ml的黃連素濃度進(jìn)行血

7、平板斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在0.5 mg/ml的黃連素濾紙周圍幾乎沒有牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)；電鏡觀察及BactlightRed熒光染色鏡下發(fā)現(xiàn)在0.05 mg/ml黃連素作用4小時(shí)相對(duì)于對(duì)照組（無黃連素）牙齦卟啉單胞菌出現(xiàn)長(zhǎng)度增長(zhǎng)；拉曼光譜技術(shù)結(jié)果證明黃連素與牙齦卟啉單胞菌之間確實(shí)存在相互作用并且改變細(xì)菌的性狀；Real-tinmePCR結(jié)果顯示同一時(shí)間點(diǎn)隨著黃連素濃度的升高ftsz基因的表達(dá)量增多，同一黃連素濃度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)Ftsz