黃連素對牙齦卟啉單胞菌的影響.pdf

1、背景：在牙周炎的發(fā)生和發(fā)展過程中，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)起著重要作用，它是慢性牙周炎的機會致病菌，也是齦下生物膜的重要組成部分。生物膜的主要成分有各種微生物細胞，胞外多糖，水及細胞的代謝產(chǎn)物，而口腔細菌就常以生物膜的方式存在于口腔中，并進一步發(fā)展成為菌斑，危害口腔健康。生物膜是一個動態(tài)的環(huán)境，在其形成的過程中細菌呈現(xiàn)的狀態(tài)以及基因的表達都會是不同的。胞外多糖構(gòu)成了生物膜的骨架，如果抑制或者破壞

2、多糖的表達將會大大影響生物膜的穩(wěn)定性和完整性[1]。近年來，一些研究已經(jīng)表明黃連素可能抑制牙齦卟啉單胞菌的生長，然而暫無任何研究闡述黃連素在P. g細菌莢膜及口腔生物膜的合成、抑制該細菌分裂增殖、等方面的分子生物學(xué)機制。P. g參與的齦下菌斑誘導(dǎo)牙齦的出血及感染，近來口腔種植體的逐步流行，術(shù)后出現(xiàn)種植體周圍炎的病例也有所增多，臨床用藥十分有限。隨著國際上對黃連素作為新型抗菌素研究的深入，本文希望通過研究黃連素作用于P. g的分子生物學(xué)機

3、制，探討黃連素作為一種新型的口腔牙周細菌生物膜抑制劑的可行性，從而達到預(yù)防和治療牙周病的效果。依據(jù)這一事實我們的長期目標(biāo)將試圖闡述黃連素抑制牙齦齦卟單胞菌表達的分子生物學(xué)機制：黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌生長與細菌分裂蛋白ftsZ的組裝功能有關(guān)；黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌的莢膜多糖及細菌生物膜的表達和合成。
　　目的：⑴探究黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌生長的分子生物學(xué)機制。⑵黃連素對牙齦卟啉單胞菌參與的生物膜產(chǎn)生抑制作用，并揭示在藥物作用下

4、牙齦卟啉單胞菌的莢膜多糖的變化。
　　方法：通過測試牙齦卟啉單胞菌W83和ATCC33277在不同濃度的黃連素作用下的生長曲線來確定黃連素是否對牙齦卟啉單胞菌的生長有影響；通過斑點血平板實驗檢測高濃度的黃連素是否能夠殺滅牙齦卟啉單胞菌；在黃連素抑制牙齦卟啉單胞菌的生長曲線的基礎(chǔ)上，使用電鏡觀察及BactlightRed熒光染色檢測黃連素是否可以改變細菌的形態(tài)，并假設(shè)細菌形態(tài)的改變是因為黃連素調(diào)控牙齦卟啉單胞菌的分裂蛋白ftsz基因

5、的表達量；通過拉曼光譜技術(shù)檢測在黃連素作用下的牙齦卟啉單胞菌的表面形貌的變化；采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測在不同濃度的黃連素作用不同的時間下編碼牙齦卟啉單胞菌分裂蛋白ftsz基因表達的變化；通過RT-PCR技術(shù)檢測在不同濃度的黃連素作用下對牙齦卟啉單胞菌的莢膜多糖合成蛋白基因的影響；通過96孔聚氯乙烯板生物膜培養(yǎng)法，使用酶標(biāo)儀測得OD570值檢測黃連素作用下生物膜的表達。
　　結(jié)果：將生長14小時的牙齦卟啉單胞菌用新鮮的TSB培

6、養(yǎng)基稀釋成OD600=0.2后，分別加入黃連素使黃連素的終濃度為0 mg/ml，0.01 mg/ml，0.05 mg/ml，0.1 mg/ml繼續(xù)生長30小時后，繪出牙齦卟啉單胞菌的生長曲線。生長曲線結(jié)果表明在黃連素濃度為0.01 mg/ml，0.05 mg/ml，0.1 mg/ml時均抑制了牙齦卟啉單胞菌W83和ATCC33277的生長；使用0 mg/ml，0.05 mg/ml，0.1 mg/ml，0.5 mg/ml的黃連素濃度進行血

7、平板斑點實驗，結(jié)果顯示在0.5 mg/ml的黃連素濾紙周圍幾乎沒有牙齦卟啉單胞菌的生長；電鏡觀察及BactlightRed熒光染色鏡下發(fā)現(xiàn)在0.05 mg/ml黃連素作用4小時相對于對照組（無黃連素）牙齦卟啉單胞菌出現(xiàn)長度增長；拉曼光譜技術(shù)結(jié)果證明黃連素與牙齦卟啉單胞菌之間確實存在相互作用并且改變細菌的性狀；Real-tinmePCR結(jié)果顯示同一時間點隨著黃連素濃度的升高ftsz基因的表達量增多，同一黃連素濃度隨著作用時間的延長Ftsz