黃連素調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抗糖尿病小鼠腎損傷的研究.pdf

1、研究背景： 糖尿病腎病(Diabeticnephropathy，DN)是糖尿病(Diabetesmellitus，DM)慢性微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和危害患者的生命健康。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，尚未完全清楚，目前認(rèn)為是多種復(fù)雜的因素，如糖代謝異常，腎臟血流動力學(xué)、蛋白質(zhì)非酶糖基化、氧化應(yīng)激、多元醇通路激活、遺傳易感基因等綜合作用的結(jié)果。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病及糖尿病腎病腎臟組織中

2、伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤，炎癥因子的異常表達(dá)，提示炎癥反應(yīng)參與了DN的發(fā)病。越來越多的研究顯示NF—кB的激活與DN的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，其作為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的一個許多相關(guān)途徑中的中心因子，對高血糖狀態(tài)下的腎臟結(jié)構(gòu)、功能的改變起重要作用，NF—кB激活后可調(diào)控多種炎性因子，細(xì)胞因子的表達(dá)，從而參與腎臟的炎性損傷。ICAM-1為介導(dǎo)單核細(xì)胞浸潤腎小球及間質(zhì)關(guān)鍵的黏附分子，纖維化因子TGF—β1在DN中的主要生物學(xué)作用是促進(jìn)腎臟細(xì)胞肥大和

3、影響ECM的代謝，目前的研究認(rèn)為TGF—β1表達(dá)增加為腎小球系膜外基質(zhì)增生進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的主要原因。且研究報道發(fā)現(xiàn)ICAM-1，TGF—β1均含有NF—кB的結(jié)合位點(diǎn)，受NF—кB的調(diào)節(jié)。FN為細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，其表達(dá)異常增加主要表現(xiàn)為系膜基質(zhì)增加，直接導(dǎo)致腎小球硬化。 黃連素是從小檗屬植物黃連、黃柏根莖中提取出的一種異喹啉類生物堿，已作為抗菌，抗病毒治療細(xì)菌性痢疾，腸道感染廣泛應(yīng)用于臨床，另外還有報道其具有降

4、血糖、降血脂、降血壓等藥理活性。本課題組前期的實驗研究表明黃連素對糖尿病大鼠的腎損傷具有明顯的改善作用，其機(jī)制與黃連素調(diào)節(jié)P38MAPK信號通路等有關(guān)。對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分FN表達(dá)的抑制作用，黃連素各組明顯優(yōu)于P38MAPK特異性抑制劑(SB352580)組，提示黃連素除影響P38MAPK信號通路外，還可能通過干預(yù)調(diào)節(jié)其它信號通路來影響細(xì)胞外基質(zhì)FN的生成。鑒于NF—кB通路激活誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)在糖尿病腎病發(fā)病中的重要

5、作用，黃連素在調(diào)節(jié)P38MAPK信號通路基礎(chǔ)上是否進(jìn)一步抑制了NF—кB的激活以減輕腎臟炎性反應(yīng)、阻抑糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展？值得進(jìn)一步探討研究。 基于此，本課題構(gòu)建四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病腎損傷小鼠模型，觀察黃連素對糖尿病腎損傷小鼠腎功能的保護(hù)作用，以及其對糖尿病腎損傷小鼠腎臟NF—кB激活，下游ICAM-1，TGF—β1以及FN的蛋白表達(dá)的影響來深入探討黃連素抗糖尿病腎病作用機(jī)制，為下一步體外實驗打下基礎(chǔ)。 研究目的：

6、 1、觀察黃連素對四氧嘧啶(Alloxan)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎損傷的保護(hù)作用。 2、觀察黃連素對四氧嘧啶(Alloxan)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎損傷模型的腎臟的NF—кB激活，ICAM-1、TGF—β1及FN的蛋白表達(dá)的影響。 研究方法： 選取40只C57BL/6雄性小鼠，SPF級，23±2g，采用200mg/L四氧嘧啶(Alloxan)單次腹腔注射造糖尿病模型，血糖>11.1mmol/L為造模成功動物。將其分

7、為模型組，黃連素給藥組，每組各8只，黃連素使用0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液配制，劑量為0.3g/kg。選取未經(jīng)造模的正常小鼠8只為正常對照組，正常組及模型組給予等體積的0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液。實驗觀察周期為期12周，實驗結(jié)束時稱體重，取血檢測腎功能相關(guān)指標(biāo)：血糖(FBG)，血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、24h尿蛋白(UP24h)，解剖取雙腎稱重、計算腎臟肥大指數(shù)；取部分腎組織常規(guī)方法制備石蠟切片，作HE染色觀察各組腎臟病理

8、改變；使用免疫組化方法觀察各組腎組織腎小球NF—кB(P65)的胞核表達(dá)情況；Westernblot方法檢測各組腎組織IкB—α、ICAM-1、TGF—β1及FN蛋白表達(dá)。 研究結(jié)果： 1.實驗12周時，模型組與正常對照組相比，體重明顯下降，腎重/體重(肥大指數(shù))、血糖、BUN、Cr、UP24h均明顯升高(P<0.05)；黃連素給藥后可顯著改善模型小鼠的腎臟肥大指數(shù)與腎功能指標(biāo)。(P<0.05)。 2.病理觀察結(jié)

9、果顯示：與正常組比較，模型組小鼠腎小球肥大，基質(zhì)增生，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞與外腎小囊粘連；黃連素給藥后，可明顯減輕上述病理改變。 3.免疫組化結(jié)果顯示：模型組小鼠腎小球內(nèi)NF—кB(P65)核染色百分含量較正常組明顯增加(P<0.05)，黃連素組NF—кB(P65)在腎小球內(nèi)核染色明顯減少(P<0.05)； 4.Westernblot結(jié)果顯示：模型組小鼠腎臟IкB—α降解明顯(P<0.05)，黃連素給藥后顯著抑制其降解(P<0