白三烯受體拮抗劑對UUO大鼠JAK2、STAT3、IL-6及Ⅲ型膠原表達的影響.pdf

1、目的：
　　腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis,RIF）是各種病因所致慢性腎臟?。╟hronic kidney diseases,CKD）發(fā)生發(fā)展的共同病理表現，是發(fā)展至終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的關鍵過程。腎間質纖維化的病理過程包括腎小管間質纖維化和晚期的腎小球硬化，表現為炎癥細胞浸潤、細胞因子激活，腎小管上皮間充質轉分化，成纖維細胞增殖，細胞外基質

2、沉積，細胞凋亡，最終導致終末期腎衰竭。隨著對CKD研究的不斷發(fā)展，發(fā)現許多細胞因子和生長因子與CKD的病理生理過程有關，如轉化生長因子β(transforming growth factorβ1,TGF-β1)，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP），瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等，不同程度的參與了CKD的發(fā)病過程。而JAK/STAT（The Janus

3、 kinase family/signal transducers and activators of transcription）通路是一條由多種細胞因子和生長因子介導的信號轉導通路，對疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的調控作用，其激活能促進各種疾病的進展，如淋巴瘤、白血病及各種炎癥性疾病。已有研究表明，JAK/STAT信號通路與糖尿病腎病、梗阻性腎病、多囊腎等腎臟疾病的病理生理過程有著密切的聯系。已證明,JAK/STAT信號通路與炎癥的進展關系

4、密切,既可以調控自身下游炎癥相關基因的表達，又可通過參與不同的信號通路發(fā)揮其生物學功能，如轉化生長因子β（TGF-β)和核因子κ B（NF-κ B)等通路。同時，巨噬細胞通過 JAK/STAT通路的信號轉導作用可誘導多種炎癥因子的激活。因此JAK/STAT信號通路對機體炎癥反應過程的調節(jié)作用尤為關鍵。
　　白三烯（Leukotrienes，LTs）是一類擁有高度生物活性的炎癥介質，在體內由炎性細胞產生，與其相關的受體也是重要的炎癥

5、介質，大量存在于炎性細胞顆粒蛋白中。目前研究發(fā)現，多種病理因素刺激可誘導 LTs在腎臟中的表達增強，從而在腎損害中發(fā)揮重要作用。因此，抑制 LTs的過度表達可能對腎臟病的治療起到有益的作用。孟魯司特（montelukast， MON，商品名：順爾寧）是一種高選擇性半胱氨酰白三烯（Cys-LT）受體拮抗劑，在臨床作為預防和治療哮喘的一種非激素類抗炎藥物被推廣應用。
　　本實驗的目的是觀察白三烯受體拮抗劑是否可延緩單側輸尿管梗阻（Un

6、ilateral Ureteral Occlusion，UUO）大鼠腎間質纖維化的進展，及其對UUO大鼠JAK2，STAT3，IL-6及Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，探究其是否通過JAK/STAT信號通路發(fā)揮抗腎間質纖維化作用，為腎間質纖維化的臨床治療提供新的理論基礎及治療靶點。
　　方法：
　　采用單側輸尿管梗阻模型，54只清潔級SD大鼠（雄性210±20g），隨機分為A、B、C三組，假手術組（A組，Sham組）18只，模型組（

7、單側輸尿管結扎組，B組，UUO組）18只，治療組（孟魯司特干預組，C組，MON組）18只，適應性喂養(yǎng)7天，按分組不同建立單側輸尿管梗阻模型。各組大鼠均于術前24小時開始給藥，治療組每天給予孟魯司特10mg/kg/d灌胃，同時Sham組和UUO組給以等容生理鹽水灌胃。自由進食飲水，分別于術后3、7、14天，每組各取6只大鼠，取左腎組織后處死，用0.9％的生理鹽水反復沖洗，取中間1/4組織塊于多聚甲醛中固定，用于病理切片，進行HE、Mass

8、on染色及免疫組織化學染色，其余腎組織放于液氮中迅速冷凍，以防止蛋白降解，并保存于-80℃冰箱中，行Western blot實驗。使用SPSS20.0統計分析軟件對所得的實驗數據進行統計學分析，以均數±標準差（x±S）表示統計結果，使用單因素方差分析對數據進行分析，P＜0.05表示結果有統計學意義。
　　結果：
　　1腎臟組織病理學染色
　　1.1光鏡下HE染色：A組：第3、7、14天，腎小球、腎小管及間質未見明顯異常

9、。B組：術后3天，腎小管發(fā)生輕度擴張，間質中可見少量炎癥細胞浸潤；術后7天腎小管管腔擴張程度和間質炎癥細胞浸潤程度加重，腎小管上皮細胞脫落，空泡樣變性；術后14天可觀察到大量腎小管萎縮，腎小管基底膜增厚，皺縮，失去正常結構。C組：與同時期B組相比，病變程度較輕，但仍明顯重于A組。
　　1.2光鏡下Masson染色：A組：第3、7、14天腎小球、腎小管及間質未見異常。B組：腎小管廣泛擴張，腎間質較前增寬，可見膠原纖維沉積，隨梗阻時間

10、的延長，膠原纖維逐漸向腎小管周圍延伸，交織成網狀“結構”。C組：與同期B組相比，腎間質膠原纖維沉積程度減輕，但仍明顯重于A組。
　　2腎組織免疫組織化學染色
　　2.1 P-JAK2
　　A組：腎小管上皮細胞胞漿P-JAK2散在表達。B組：大鼠腎小管上皮細胞胞漿內陽性表達顯著增加。隨著梗阻時間的延長，其表達水平呈進行性增高，且與A組同時期相比均有統計學意義（P均＜0.05）。C組：P-JAK2表達水平與同時期B組相比均

11、有顯著下降（P均＜0.05），但仍高于同時期A組中的表達水平（P均＜0.05）。
　　2.2 P-STAT3
　　A組：在腎小管上皮細胞核幾乎不表達。B組：與A組相比，P-STAT3在大鼠腎小管上皮細胞核內表達增加。隨著病變時間的延長，腎小管上皮細胞核中出現表達逐漸增加。與A組同時期相比均有統計學意義（P均＜0.05）。C組：術后第3、7、14天，與同時期B組相比，腎小管上皮細胞核表達水平降低（P均＜0.05）。但與A組同時

12、期相比，表達水平均較高（P均＜0.05）。
　　2.3 IL-6
　　A組：腎小管上皮細胞胞漿中微量表達。B組：細胞胞漿中陽性表達明顯增加，隨著病變的進展，表達水平持續(xù)增加，與同一時期 A組相比均有統計學差異（P均＜0.05）。C組：與同時期B組相比，術后第3、7、14天，IL-6表達水平明顯下降（P均＜0.05）；但與A組同時期相比，表達水平均高于A組（P均＜0.05）。
　　2.4Ⅲ型膠原
　　A組：正常情況

13、下Ⅲ型膠原在腎小球系膜細胞胞漿、腎小管上皮細胞以及間質細胞中有少量表達。B組：腎小管上皮細胞表達水平增加，腎間質表達不明顯，隨梗阻時間延長表達增加（P均＜0.05）。且表達水平均高于同時期A組（P均＜0.05）。C組：Ⅲ型膠原表達水平與同時期B組相比均有顯著下降（P均＜0.05），但仍高于同時期A組中的表達水平（P均＜0.05）。
　　3腎組織中P-JAK2、P-STAT3 Western Blot結果
　　P-JAK2蛋白

14、：B組術后3、7、14天P-JAK2蛋白的表達量逐漸增加（P均＜0.05），與同期A組相比，表達量均增加（P均＜0.05）；C組術后各時期P-JAK2蛋白表達量隨梗阻時間延長逐漸增加（P均＜0.05），與同時相B組相比較表達量減少（P均＜0.05），但仍高于同時相A組（P均＜0.05）。
　　P-STAT3蛋白：與同期A組相比，B組和C組術后3、7、14天目的蛋白的表達量均增加（P均＜0.05），并隨梗阻時間的延長表達量逐漸增加（

15、P均＜0.05），C組術后各時期P-STAT3蛋白表達量隨時間延長逐漸增加（P均＜0.05），與同時相B組相比較表達量減少（P均＜0.05），但仍高于同時相A組（P均＜0.05）。
　　結論：
　　1 JAK2/STAT3信號通路可能參與了UUO大鼠模型腎間質纖維化的進展。
　　2在UUO大鼠模型中，白三烯受體拮抗劑可能具有抗纖維化作用，其機制可能是通過降低炎癥因子的表達，從而抑制JAK2/STAT3信號通路的激活而實