半胱氨酰白三烯受體2對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)及其siRNA和拮抗劑篩選.pdf

1、目的:在大膠質(zhì)瘤鼠C6細(xì)胞,半胱氨酰白三烯受體2(CysLT2受體)是其主要表達(dá)的CysLT受體亞型,但是其效應(yīng)特點(diǎn)尚不清楚。為探索該受體亞型的效應(yīng)特點(diǎn),本研究探討以下問(wèn)題:(1)CysLT2受體是否對(duì)C6細(xì)胞的分化有調(diào)節(jié)作用;(2)為增加研究手段,篩選CysLT2受體siRNA慢病毒干擾表達(dá)載體;(3)以LTD4誘導(dǎo)C6細(xì)胞內(nèi)鈣增高為指標(biāo),初篩系列合成化合物,尋找具有CysLT2受拮抗活性的化合物。
　　 方法:RT-PCR檢

2、測(cè)CysLT2受體mRNA表達(dá)變化,免疫細(xì)胞化學(xué)觀察CysLT2受體在C6細(xì)胞內(nèi)的分布情況。為確定LTD4及CysLT1受體拮抗劑對(duì)細(xì)胞分化的作用,以明場(chǎng)拍照觀察C6細(xì)胞形態(tài),免疫印跡觀察GFAP蛋白表達(dá)。為確定CysLT2受體siRNA,以熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率,RT-PCR和real-timePCR觀察CysLT2受體mRNA表達(dá)變化,免疫印跡觀察CysLT2受體蛋白表達(dá)變化,用激光共聚焦顯微鏡測(cè)定鈣信號(hào),觀察激動(dòng)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞

3、內(nèi)鈣變化。為篩選CysLT2受體拮抗活性化合物,以激動(dòng)劑LTD4處理后檢測(cè)C6細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化作為指標(biāo),初步篩選有拮抗劑活性的化合物,并以CysLTl/CysLT2受體非選擇性拮抗劑Bayu9773和CysLT2受體選擇性拮抗劑AP-100984作為參照。
　　 結(jié)果:RT-PCR鑒定表明,C6細(xì)胞高表達(dá)CysLT2受體,主要分布于C6細(xì)胞的細(xì)胞漿。激動(dòng)劑LTD4不能誘導(dǎo)C6細(xì)胞的形態(tài)變化及GFAP蛋白表達(dá);CysLT1受體拮抗

4、劑孟魯司特單獨(dú)作用無(wú)誘導(dǎo)C6細(xì)胞分化的作用,但與LTD4合用可誘導(dǎo)C6細(xì)胞突起變長(zhǎng),分支數(shù)變多,即誘導(dǎo)分化變化。篩選獲得了CysLT2受體siRNA慢病毒干擾表達(dá)載體;CysLT2受體慢病毒SH3表達(dá)載體作用于C6細(xì)胞,可抑制其CysLT2受體mRNA及蛋白表達(dá)以及LTC4誘導(dǎo)的內(nèi)鈣升高。LTD41μmol/L能顯著升高C6細(xì)胞內(nèi)鈣,其作用約為陽(yáng)性對(duì)照ATP的37.5％,以此為指標(biāo)篩選具有CysLT2受體拮抗活性的化合物;CysLT2受

5、體拮抗劑AP-100984抑制LTD4誘導(dǎo)的C6細(xì)胞內(nèi)鈣升高,CysLT1受體選擇性拮抗劑無(wú)抑制作用;化合物中Dxw-1、2,13、23、29、30能抑制LTD4誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣升高。
　　 結(jié)論:(1)C6細(xì)胞主要表達(dá)CysLT2受體。單獨(dú)應(yīng)用CysLT受體激動(dòng)劑LTD4和CysLT1受體拮抗劑孟魯司特對(duì)C6細(xì)胞分化沒(méi)有作用,而兩者合用可促進(jìn)C6細(xì)胞分化,提示CysLT2受體可能促進(jìn)C6細(xì)胞分化。(2)成功篩選出CysLT2受體