丁苯酞對(duì)糖尿病db-db小鼠認(rèn)知功能障礙及膽堿能系統(tǒng)和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能下降，以學(xué)習(xí)、記憶能力減退為主要特征，甚至可發(fā)展為癡呆。海馬是參與學(xué)習(xí)、記憶的重要結(jié)構(gòu)。研究表明海馬中膽堿能系統(tǒng)功能受損與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡參與認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, ChAT)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)維持腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine

2、, ACh）動(dòng)態(tài)平衡，其活性是評(píng)價(jià)大腦皮質(zhì)和海馬功能的標(biāo)志。在細(xì)胞凋亡中，Caspase-3是最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者，Bcl-2是公認(rèn)的凋亡抑制基因。丁苯酞(L-3-n-butylphthalide, NBP)可改善認(rèn)知功能障礙，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于丁苯酞對(duì)糖尿病相關(guān)的認(rèn)知功能障礙的影響研究甚少。本研究預(yù)防性應(yīng)用丁苯酞，觀察丁苯酞對(duì)糖尿病db/db小鼠海馬神經(jīng)元組織ChAT、AChE、Caspase-3、Bcl-2表達(dá)的影響，并探索糖尿病認(rèn)知功能障

3、礙的可能發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共24只，其中8只6周齡健康雄性db/m小鼠，作為正常對(duì)照組（NC, n=8只），余下的16只6周齡健康雄性小鼠為糖尿病db/db小鼠，將其隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組（DM-C, n=8只），丁苯酞干預(yù)組（DM-NBP, n=8只）。
　　2.藥物干預(yù)
　　適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后， DM-NBP組小鼠給予溶于植物油的丁苯酞(120mg/kg/d)灌胃，N

4、C組及DM-C組小鼠給予等量的植物油灌胃，共進(jìn)行6周。
　　3.一般觀察
　　觀察小鼠的精神狀態(tài)、毛色、進(jìn)食情況、攝水量及尿量變化情況，每周記錄小鼠體重及血糖變化。
　　4.行為學(xué)檢測(cè)
　　藥物干預(yù)6周后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行水迷宮測(cè)試，評(píng)價(jià)各組小鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力，連續(xù)5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠的逃避潛伏期，于第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)。
　　5.ELISA法、Real Time PCR

5、、Western Blot檢測(cè)
　　空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠處死，取其海馬組織，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)ChAT和AChE含量。應(yīng)用熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（Real Time Polymerase chain reaction, Real Time PCR）及蛋白免疫印跡反應(yīng)（Western-Blot, WB）分別檢測(cè)海馬組織Caspase-3

6、、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)?標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析和完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩兩比較應(yīng)用S-N-K檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.一般情況觀察(體重:g血糖:mmol/L)
　　DM-C組和DM-NBP組小鼠毛發(fā)稀疏無(wú)光澤，反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)明顯的多

7、尿、多飲、多食癥狀。NC組小鼠一般情況良好，無(wú)上述多尿、多飲、多食癥狀。藥物干預(yù)6周后，與NC組比較，DM-C組和DM-NBP組小鼠體重、血糖明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（體重：58.06±2.38,57.34±2.17 vs26.39±1.66；血糖：20.94±1.71,20.03±1.66 vs7.21±0.91, P<0.05）,DM-C組和DM-NBP組小鼠體重和血糖無(wú)明顯差異（體重：58.06±2.38 vs57.34±2.1

8、7;血糖:20.94±1.71 vs20.03±1.66, P>0.05）(Table1)。
　　2.行為學(xué)測(cè)試結(jié)果
　　2.1.基礎(chǔ)游泳速度測(cè)定結(jié)果(cm/s)
　　首先在進(jìn)行定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)前，測(cè)定各組小鼠的基礎(chǔ)游泳速度，為此將小鼠放入泳池中自由游泳60秒,記錄游泳速度，結(jié)果顯示NC組、DM-C組和DM-NBP組小鼠基礎(chǔ)游泳速度無(wú)明顯差異（138.33±7.40 vs134.70±8.28 vs136.64±

9、7.14, P>0.05）(Fig.1, Table2)。
　　2.2.定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(s)
　　定位航行實(shí)驗(yàn)第1天，各組小鼠逃避潛伏期無(wú)明顯差異（58.06±1.82 vs56.57±2.85 vs58.11±1.57, P>0.05）。第2-5天，DM-C組小鼠逃避潛伏期較NC組明顯延長(zhǎng)（P<0.05）(Fig.1, Table3)，而經(jīng)丁苯酞干預(yù)的DM-NBP組與未經(jīng)干預(yù)的DM-C組比較，小鼠的逃避潛伏期顯著縮短，但

10、仍較正常對(duì)照組延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）(Fig.2, Table3)。
　　2.3.空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(次/60s)
　　在空間探索實(shí)驗(yàn)中， DM-C組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于NC組（P<0.05）。然而，丁苯酞干預(yù)的DM-NBP組小鼠與未經(jīng)干預(yù)的DM-C組比較顯著增加了穿越平臺(tái)次數(shù)，但仍少于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig.3, Table4)。
　　三組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)依次為：NC組>D

11、M-NBP組>DM-C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（7.00±0.76 vs5.13±0.64 vs2.38±0.52, P<0.05）。
　　3.小鼠海馬組織中ChAT和AChE的變化(pg/ml)
　　DM-C組小鼠海馬組織中ChAT含量明顯低于NC組（32.24±4.28 vs104.21±4.50, P<0.05）；然而，經(jīng)丁苯酞干預(yù)6周的DM-NBP組小鼠，與未干預(yù)的DM-C組比較，海馬組織ChAT含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)意義（49.88±6.05 vs32.24±4.28, P<0.05）(Fig.4, Table5)。
　　與ChAT結(jié)果相反，DM-C組小鼠海馬組織AChE含量明顯高于NC組（108.92±5.64 vs58.64±6.71，P<0.05）；有意義的是丁苯酞干預(yù)避免了AChE的升高，導(dǎo)致DM-NBP組小鼠海馬組織AChE含量顯著低于DM-C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（83.70±4.95 vs108.92±5.64, P<0.05）

13、(Fig.5, Table6)。
　　4.細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化
　　DM-C組小鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于NC組（P<0.05）；經(jīng)丁苯酞干預(yù)6周的DM-NBP組小鼠，與未經(jīng)干預(yù)的DM-C組比較，小鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，但仍高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）(Fig.6，F(xiàn)ig.8，F(xiàn)ig.10，Table7，Table9)。
　　與

14、Caspase-3結(jié)果相反，DM-C組小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于NC組；經(jīng)丁苯酞干預(yù)的DM-NBP組小鼠，與未經(jīng)干預(yù)的DM-C組比較，小鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加，但仍低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）(Fig.7，F(xiàn)ig.9，F(xiàn)ig.10，Table8，Table10)。
　　結(jié)論：
　　1.糖尿病db/db小鼠13周齡時(shí)學(xué)習(xí)、記憶能力明顯下降。
　　2.