丁苯酞對糖尿病db-db小鼠認(rèn)知功能及NADPH氧化酶p67phox亞基、gp91phox亞基的影響.pdf

1、目的：糖尿病可以導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，成為目前研究的熱點(diǎn)。研究表明氧化應(yīng)激是糖尿病認(rèn)知功能障礙的重要發(fā)病機(jī)制之一，NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)在氧化應(yīng)激中起中樞作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)，是檢驗(yàn)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。丁苯酞可以改善糖尿病認(rèn)知功能障礙，但其具體機(jī)制尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在對糖尿病db/db小鼠預(yù)

2、防性應(yīng)用丁苯酞，觀察丁苯酞對糖尿病db/db小鼠認(rèn)知功能及其海馬組織中SOD、MDA及NADPH氧化酶p67phox亞基、gp91phox亞基的影響。
　　方法：
　　1.分組
　　6周齡雄性db/m小鼠8只作為正常對照組（NC, n=8只）。雄性db/db小鼠16只，隨機(jī)分為糖尿病對照組（DM-C, n=8只），糖尿病丁苯酞組（DM-NBP, n=8只）。
　　2.藥物干預(yù)
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，

3、給予DM-NBP組小鼠丁苯酞灌胃（丁苯酞?jiǎng)┝繛?20mg/Kg/d），NC組及DM-C組小鼠給予等量的植物油灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)6周。
　　3.一般觀察
　　每周監(jiān)測各組小鼠的血糖、體重變化。觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食情況、攝水量及尿量等一般情況。
　　4.行為學(xué)檢測
　　丁苯酞干預(yù)6周后，進(jìn)行水迷宮測試，分析各組小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。包括連續(xù)5天的定位航行實(shí)驗(yàn),記錄各組小鼠的逃避潛伏期，于第6天進(jìn)行空間探索

4、實(shí)驗(yàn)，記錄各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)。
　　5.ELISA、Western-Blot、Real Time PCR檢測
　　水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死各組小鼠，取其海馬組織，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)檢測SOD與MDA的含量。蛋白免疫印跡法(Western-Blot, WB)檢測NADPH氧化酶p67phox亞基、gp91phox亞基蛋白的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量-聚

5、合酶鏈反應(yīng)(Real Time Polymerase Chain Reaction, Real Time PCR)檢測NADPH氧化酶p67phox亞基、gp91phox亞基mRNA的表達(dá)水平。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s)表示，應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析、重復(fù)測量方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，三組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.一般情況
　　NC組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光順，進(jìn)食水量、尿量正常。DM-C組及DM-NBP組小鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食癥狀，毛發(fā)稀疏無光澤，精神萎靡。干預(yù)過程中，DM-NBP組小鼠一般情況優(yōu)于DM-C組。
　　丁苯酞干預(yù)6周后，測定各組小鼠體重（g）。結(jié)果顯示，與NC組（26.39±1.66）相比，DM-C組（58.06±2.38）與DM-NBP組（57.34±2.17）小鼠體重

7、顯著增加（P<0.05）。與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠體重?zé)o明顯差異（P>0.05）。
　　丁苯酞干預(yù)6周后，取尾靜脈血測定各組小鼠的血糖（mmol/L）。結(jié)果顯示，與NC組（7.21±0.91）相比，DM-C組（20.94±1.71）與DM-NBP組（20.03±1.66）小鼠血糖明顯升高（P<0.05）。與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠血糖無顯著差異（P>0.05）。
　　2.行為學(xué)觀察：Morris水迷宮測

8、試
　　2.1.基礎(chǔ)游泳速度測定（cm/s）
　　實(shí)驗(yàn)開始前，為排除個(gè)體差異，讓各組小鼠自由游泳60s，測定基礎(chǔ)游泳速度。結(jié)果顯示NC組（138.33±7.40）、DM-C組（134.70±8.28）與DM-NBP組（136.64±7.14）三組小鼠間基礎(chǔ)游泳速度無顯著差異（P>0.05）。
　　2.2.逃避潛伏期測定（s）
　　定位航行第1天，各組小鼠間逃避潛伏期無明顯差異（P>0.05）。第2-5天，與NC組

9、相比，DM-C組與DM-NBP組小鼠逃避潛伏期均明顯延長（P<0.05）；與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05）。
　　各組小鼠隨著天數(shù)增加逃避潛伏期逐漸縮短：Day1>Day2>Day3>Day4>Day5。
　　2.3.空間探索實(shí)驗(yàn)：穿越平臺(tái)次數(shù)（次/60 s）
　　與NC組（7.00±0.76）相比，DM-NBP組（5.13±0.64）、DM-C組（2.38±0.52）小鼠穿越平臺(tái)

10、次數(shù)均明顯減少(P<0.05）。與DM-C組相比， DM-NBP組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05）。
　　3.Real Time PCR結(jié)果
　　NADPH氧化酶p67phox亞基mRNA的表達(dá)：與NC組（0.686±0.015）相比，DM-C組（1.003±0.026）、DM-NBP組（0.802±0.023）小鼠海馬組織中 NADPH氧化酶 p67phox亞基 mRNA的表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）。與DM

11、-C組相比，DM-NBP組小鼠海馬組織中NADPH氧化酶p67phox亞基mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。
　　NADPH氧化酶gp91phox亞基mRNA的表達(dá)：與NC組（0.629±0.054）相比，DM-C組（1.020±0.019）、DM-NBP組（0.784±0.020）小鼠海馬組織中NADPH氧化酶gp91phox亞基mRNA的表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）。與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠海馬組織

12、中NADPH氧化酶gp91phox亞基mRNA的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。
　　4.WB結(jié)果
　　NADPH氧化酶p67phox亞基蛋白的表達(dá)：與NC組（0.574±0.055）相比，DM-C組（1.310±0.019）、DM-NBP組（1.071±0.023）小鼠海馬組織內(nèi)NADPH氧化酶p67phox亞基蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠海馬組織內(nèi)NADPH氧化酶p67ph

13、ox亞基蛋白的表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。
　　NADPH氧化酶gp91phox亞基蛋白的表達(dá)：與NC組（0.690±0.028）相比，DM-C組（1.516±0.024）、DM-NBP組（1.258±0.026）小鼠海馬組織中NADPH氧化酶gp91phox亞基蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠海馬組織中NADPH氧化酶gp91phox亞基蛋白的表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。
　　5

14、.ELISA結(jié)果
　　SOD含量（ng/ml）：與NC組（112.311±3.078）相比，DM-C組（43.602±1.808）、DM-NBP組（51.544±1.482）小鼠海馬組織中SOD含量均明顯降低（P<0.05）。與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠海馬組織中SOD含量明顯升高（P<0.05）。
　　MDA含量（pg/ml）：與NC組（0.858±0.047）相比，DM-C組（1.353±0.111）、DM-NB

15、P組（1.024±0.043）小鼠海馬組織中MDA的含量均明顯升高（P<0.05）。與DM-C組相比，DM-NBP組小鼠海馬組織中MDA的含量明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.13周齡的糖尿病db/db小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力明顯下降。
　　2.丁苯酞可以改善糖尿病db/db小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。
　　3.13周齡的糖尿病db/db小鼠海馬組織中MDA的含量增加，SOD的含量降低，提示氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，抗氧