紅芪多糖對db-db小鼠糖尿病心肌病心肌保護作用及PPARγ-NF-κB信號通路的影響.pdf

1、目的：本研究以自發(fā)性肥胖型2型糖尿病db/db小鼠為研究對象，觀察紅芪多糖（HPS）對糖尿病心肌?。―CM）心肌的保護作用，借助PCR Array篩選模型動物心肌纖維化的相關基因，尋找控制氧化應激和炎癥反應的重要基因和途徑，驗證模型動物DCM發(fā)病過程中心肌組織PPARγ/NF-κB信號通路及其下游相關基因的表達及HPS干預的影響，探討HPS干預DCM心肌纖維化的作用機理，揭示具有補氣化瘀功效的紅芪之有效成分HPS治療糖尿病及其慢性并發(fā)癥

2、“虛、瘀、毒”病機理論的科學內(nèi)涵，為HPS防治DCM提供科學依據(jù)。
　　方法：本研究分為以下三部分內(nèi)容
　?。?）第一部分：6周齡雄性2型糖尿病db/db小鼠60只，隨機分為HPS高、中、低劑量組、羅格列酮組和模型組5組；同周齡同品系非糖尿病db/m小鼠12只作為正常組。灌胃給藥8周后，心臟取血，頸椎脫臼處死后取出心臟。全自動生化分析儀檢測血清LDH、CK-MB、TC、TG的含量；ELISA法測定心肌中羥脯氨酸（Hyp）含量

3、；HE、Masson染色觀察小鼠心肌組織病理學改變及纖維化程度，透射電鏡觀察小鼠心肌組織超微結(jié)構；qPCR和Western blot法檢測心肌Collagen I和Collagen III mRNA和蛋白的表達；做Collagen I、Collagen III的蛋白表達與Masson染色膠原纖維陽性染色面積值的相關研究。
　?。?）第二部分：6周齡db/db小鼠3只作為模型組，db/m小鼠3只作為正常組，喂養(yǎng)8周后處死取出心臟，采

4、用PCR Array篩選糖尿病db/db小鼠與非糖尿病db/m小鼠心肌組織之間差異表達的基因，探討DCM心肌纖維化的發(fā)病機理及尋找PPARγ控制氧化應激和炎癥反應信號通路中的關鍵基因，為下一步深入研究HPS防治DCM心肌纖維化提供更精準的作用靶點和調(diào)控機制。
　?。?）第三部分：實驗動物及分組灌胃給藥同第一部分，于干預第8周末處死取出心臟。檢測心肌組織中SOD和GSH-PX的活性、MDA的含量以及心肌組織TNF-α和IL-6的含量

5、；qPCR和Western blot檢測心肌PPARγ、NF-κB、GLUT-4、IKKβ、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達，分析各個指標與心肌纖維化的相關性以及PPARγ／NF-κB信號通路與氧化應激和炎癥反應的相關性。
　　結(jié)果
　　1.①HPS高、中劑量組及羅格列酮組血糖在第2、4、6、8周均明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。與正常組比較，模型組TG、TC、LDH、CK-MB水平均明顯升高（P＜

6、0.01），HPS高、中劑量組和羅格列酮組小鼠血清TG、TC、LDH、CK-MB水平較模型組明顯降低（P＜0.01），尤其在降低血清TC、LDH和CKMB方面，HPS高劑量組最為顯著（P＜0.05或P＜0.01）。②模型組心肌組織Hyp含量明顯高于正常組（P＜0.01），各干預組Hyp含量均明顯降低（P＜0.01），尤其以HPS高劑量組最明顯。③光鏡下HE和Masson染色可見模型組小鼠心肌細胞肥大、結(jié)構模糊、排列紊亂，邊界不清，伴有大

7、量心肌成纖維細胞增生，細胞核出現(xiàn)固縮，有的裂解丟失，肌纖維斷裂、分離，細胞間質(zhì)見炎性細胞浸潤；Masson染色見模型組小鼠心肌間質(zhì)亮綠色膠原纖維及半定量分析膠原纖維陽性染色面積比值都較正常組明顯增多（P＜0.01），而各干預組小鼠心肌病理損害得到明顯改善、心肌膠原纖維陽性染色面積明顯減少（P＜0.01），尤其以HPS高劑量組最明顯。④電鏡結(jié)果顯示：模型組心肌細胞肌纖維稀疏、扭曲，肌絲溶解斷裂，明帶和暗帶紊亂，細胞核濃縮；線粒體腫脹變性，

8、嵴減少且大部分融合、斷裂，可見糖原顆粒和脂滴沉積；而HPS高劑量組和羅格列酮組心肌超微結(jié)構損傷較模型組明顯減輕。⑤qPCR和Western Blot結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌中Collagen I和Collagen III mRNA和蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01）， I/III型膠原蛋白比值升高；8周后，各干預組Collagen I和Collagen III mRNA和蛋白表達水平較模型組明顯降低（P＜0.01），I/II

9、I型膠原蛋白比值也明顯降低。⑥心肌組織中Collagen I、Collagen III的蛋白表達與Masson染色膠原纖維陽性染色面積比值均呈正相關（P＜0.01）。
　　2.與正常組比較，模型組84個基因中有64個基因出現(xiàn)差異，其中上調(diào)61個基因，下調(diào)3個基因。差異表達基因分類如下：①與糖尿病發(fā)生發(fā)展有關的受體、轉(zhuǎn)運和通道基因表達上調(diào)17個，下調(diào)了1個Slc2a4(Glut4)；轉(zhuǎn)錄因子類基因表達上調(diào)11個，如Nfkb1、Nrf

10、1等；信號轉(zhuǎn)導類基因表達上調(diào)9個：如Ikbkb(IKKβ)、Irs1、Irs2、Mapk14(p38alpha)等，核受體基因PPARα和PPARγ表現(xiàn)為下調(diào)；②PPARγ靶標基因：脂肪生成類Adipoq表達上調(diào)，脂肪酸代謝類上調(diào)10個基因，如Acsl3、Acsl4等。③PPAR通路上調(diào)了Acsl3、Acsl4等5個基因，其中Acsl3、Acsl4兩個基因同時存在于脂肪酸代謝類中。④氧化應激類的靶基因上調(diào)6個，如Gclc、Gsr、Hmo

11、x1、Nqo1等；⑤轉(zhuǎn)化生長因子-β的靶基因上調(diào)了4個。
　　3.①與正常組比較，模型組小鼠心肌組織中SOD、GSH-PX活性降低（P＜0.01），MDA含量升高（P＜0.01），IL-6、TNF-α的含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，HPS高、中劑量組及羅格列酮組SOD、GSH-PX活性增強（P＜0.01），MDA含量降低（P＜0.01或 P＜0.05），IL-6、TNF-α的含量降低（P＜0.01），其中HPS高劑量組與

12、羅格列酮組療效相當。②與正常組比較，模型組心肌組織中PPARγ、GLUT-4、MMP-2 mRNA和蛋白表達量明顯降低（P＜0.01），NF-κB、IKKβ、MMP9 mRNA和蛋白表達量明顯升高（P＜0.01），與模型組比較，HPS高、中劑量組和羅格列酮組心肌組織中PPARγ、GLUT-4、MMP2 mRNA和蛋白的表達均明顯升高（P＜0.01），NF-κB、IKKβ、MMP9 mRNA和蛋白的表達明顯降低（P＜0.01），且HPS高

13、劑量組作用相對優(yōu)于羅格列酮組（P＜0.01）。③心肌組織中Hyp含量與 TNF-α、IL-6、MDA的水平呈正相關（P＜0.01），與SOD、GSH-PX的水平呈負相關（P＜0.01）；心肌組織膠原纖維陽性染色面積與PPARγ蛋白表達呈負相關（P＜0.01），與NF-κB蛋白表達呈正相關，（P＜0.01）；PPARγ蛋白表達水平與SOD、GSH-PX水平呈正相關，（P＜0.01），與MDA水平呈負相關，（P＜0.01）；NF-κB蛋白表

14、達與IL-6、TNF-α含量均呈正相關，（P＜0.01）。
　　結(jié)論
　　1.HPS能減輕模型動物DCM心肌細胞和組織的損傷，減輕心肌膠原沉積和間質(zhì)纖維化，其作用機制可能與抑制心肌組織中Collagen I和Collagen III的表達有關。
　　2.通過本研究設計定制的PCR Array芯片篩選，初步發(fā)現(xiàn)了PPARγ/NF-κB及所調(diào)控的下游炎癥反應、氧化應激、脂肪酸代謝等64個表型基因參與了糖尿病心肌病db/db

15、小鼠心肌纖維化的病理過程。
　　3.HPS可顯著減輕模型動物DCM心肌組織的炎癥反應，改善心肌氧化應激狀態(tài)，其作用機制可能與調(diào)控PPARγ/NF-κB信號通路及下游相關細胞因子有關。
　　4.血糖、血脂、Collagen I、Collagen III、TNF-α、IL-6、MDA、NF-κB、IKKβ、MMP9的表達增強是加快模型動物DCM心肌細胞和組織損傷、心肌組織炎癥反應、氧化應激以及心肌膠原沉積和間質(zhì)纖維化的病理基礎，