紅芪多糖對(duì)db-db小鼠糖尿病心肌病心肌保護(hù)作用及PPARγ-NF-κB信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：本研究以自發(fā)性肥胖型2型糖尿病db/db小鼠為研究對(duì)象，觀察紅芪多糖（HPS）對(duì)糖尿病心肌?。―CM）心肌的保護(hù)作用，借助PCR Array篩選模型動(dòng)物心肌纖維化的相關(guān)基因，尋找控制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要基因和途徑，驗(yàn)證模型動(dòng)物DCM發(fā)病過(guò)程中心肌組織PPARγ/NF-κB信號(hào)通路及其下游相關(guān)基因的表達(dá)及HPS干預(yù)的影響，探討HPS干預(yù)DCM心肌纖維化的作用機(jī)理，揭示具有補(bǔ)氣化瘀功效的紅芪之有效成分HPS治療糖尿病及其慢性并發(fā)癥

2、“虛、瘀、毒”病機(jī)理論的科學(xué)內(nèi)涵，為HPS防治DCM提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：本研究分為以下三部分內(nèi)容
　?。?）第一部分：6周齡雄性2型糖尿病db/db小鼠60只，隨機(jī)分為HPS高、中、低劑量組、羅格列酮組和模型組5組；同周齡同品系非糖尿病db/m小鼠12只作為正常組。灌胃給藥8周后，心臟取血，頸椎脫臼處死后取出心臟。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清LDH、CK-MB、TC、TG的含量；ELISA法測(cè)定心肌中羥脯氨酸（Hyp）含量

3、；HE、Masson染色觀察小鼠心肌組織病理學(xué)改變及纖維化程度，透射電鏡觀察小鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)；qPCR和Western blot法檢測(cè)心肌Collagen I和Collagen III mRNA和蛋白的表達(dá)；做Collagen I、Collagen III的蛋白表達(dá)與Masson染色膠原纖維陽(yáng)性染色面積值的相關(guān)研究。
　　（2）第二部分：6周齡db/db小鼠3只作為模型組，db/m小鼠3只作為正常組，喂養(yǎng)8周后處死取出心臟，采

4、用PCR Array篩選糖尿病db/db小鼠與非糖尿病db/m小鼠心肌組織之間差異表達(dá)的基因，探討DCM心肌纖維化的發(fā)病機(jī)理及尋找PPARγ控制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，為下一步深入研究HPS防治DCM心肌纖維化提供更精準(zhǔn)的作用靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制。
　?。?）第三部分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組灌胃給藥同第一部分，于干預(yù)第8周末處死取出心臟。檢測(cè)心肌組織中SOD和GSH-PX的活性、MDA的含量以及心肌組織TNF-α和IL-6的含量

5、；qPCR和Western blot檢測(cè)心肌PPARγ、NF-κB、GLUT-4、IKKβ、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，分析各個(gè)指標(biāo)與心肌纖維化的相關(guān)性以及PPARγ／NF-κB信號(hào)通路與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。
　　結(jié)果
　　1.①HPS高、中劑量組及羅格列酮組血糖在第2、4、6、8周均明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。與正常組比較，模型組TG、TC、LDH、CK-MB水平均明顯升高（P＜

6、0.01），HPS高、中劑量組和羅格列酮組小鼠血清TG、TC、LDH、CK-MB水平較模型組明顯降低（P＜0.01），尤其在降低血清TC、LDH和CKMB方面，HPS高劑量組最為顯著（P＜0.05或P＜0.01）。②模型組心肌組織Hyp含量明顯高于正常組（P＜0.01），各干預(yù)組Hyp含量均明顯降低（P＜0.01），尤其以HPS高劑量組最明顯。③光鏡下HE和Masson染色可見模型組小鼠心肌細(xì)胞肥大、結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂，邊界不清，伴有大

7、量心肌成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，有的裂解丟失，肌纖維斷裂、分離，細(xì)胞間質(zhì)見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Masson染色見模型組小鼠心肌間質(zhì)亮綠色膠原纖維及半定量分析膠原纖維陽(yáng)性染色面積比值都較正常組明顯增多（P＜0.01），而各干預(yù)組小鼠心肌病理?yè)p害得到明顯改善、心肌膠原纖維陽(yáng)性染色面積明顯減少（P＜0.01），尤其以HPS高劑量組最明顯。④電鏡結(jié)果顯示：模型組心肌細(xì)胞肌纖維稀疏、扭曲，肌絲溶解斷裂，明帶和暗帶紊亂，細(xì)胞核濃縮；線粒體腫脹變性，

8、嵴減少且大部分融合、斷裂，可見糖原顆粒和脂滴沉積；而HPS高劑量組和羅格列酮組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較模型組明顯減輕。⑤qPCR和Western Blot結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌中Collagen I和Collagen III mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加（P＜0.01）， I/III型膠原蛋白比值升高；8周后，各干預(yù)組Collagen I和Collagen III mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低（P＜0.01），I/II

9、I型膠原蛋白比值也明顯降低。⑥心肌組織中Collagen I、Collagen III的蛋白表達(dá)與Masson染色膠原纖維陽(yáng)性染色面積比值均呈正相關(guān)（P＜0.01）。
　　2.與正常組比較，模型組84個(gè)基因中有64個(gè)基因出現(xiàn)差異，其中上調(diào)61個(gè)基因，下調(diào)3個(gè)基因。差異表達(dá)基因分類如下：①與糖尿病發(fā)生發(fā)展有關(guān)的受體、轉(zhuǎn)運(yùn)和通道基因表達(dá)上調(diào)17個(gè)，下調(diào)了1個(gè)Slc2a4(Glut4)；轉(zhuǎn)錄因子類基因表達(dá)上調(diào)11個(gè)，如Nfkb1、Nrf

10、1等；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因表達(dá)上調(diào)9個(gè)：如Ikbkb(IKKβ)、Irs1、Irs2、Mapk14(p38alpha)等，核受體基因PPARα和PPARγ表現(xiàn)為下調(diào)；②PPARγ靶標(biāo)基因：脂肪生成類Adipoq表達(dá)上調(diào)，脂肪酸代謝類上調(diào)10個(gè)基因，如Acsl3、Acsl4等。③PPAR通路上調(diào)了Acsl3、Acsl4等5個(gè)基因，其中Acsl3、Acsl4兩個(gè)基因同時(shí)存在于脂肪酸代謝類中。④氧化應(yīng)激類的靶基因上調(diào)6個(gè)，如Gclc、Gsr、Hmo

11、x1、Nqo1等；⑤轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的靶基因上調(diào)了4個(gè)。
　　3.①與正常組比較，模型組小鼠心肌組織中SOD、GSH-PX活性降低（P＜0.01），MDA含量升高（P＜0.01），IL-6、TNF-α的含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，HPS高、中劑量組及羅格列酮組SOD、GSH-PX活性增強(qiáng)（P＜0.01），MDA含量降低（P＜0.01或 P＜0.05），IL-6、TNF-α的含量降低（P＜0.01），其中HPS高劑量組與

12、羅格列酮組療效相當(dāng)。②與正常組比較，模型組心肌組織中PPARγ、GLUT-4、MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），NF-κB、IKKβ、MMP9 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），與模型組比較，HPS高、中劑量組和羅格列酮組心肌組織中PPARγ、GLUT-4、MMP2 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯升高（P＜0.01），NF-κB、IKKβ、MMP9 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），且HPS高

13、劑量組作用相對(duì)優(yōu)于羅格列酮組（P＜0.01）。③心肌組織中Hyp含量與 TNF-α、IL-6、MDA的水平呈正相關(guān)（P＜0.01），與SOD、GSH-PX的水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；心肌組織膠原纖維陽(yáng)性染色面積與PPARγ蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與NF-κB蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，（P＜0.01）；PPARγ蛋白表達(dá)水平與SOD、GSH-PX水平呈正相關(guān)，（P＜0.01），與MDA水平呈負(fù)相關(guān)，（P＜0.01）；NF-κB蛋白表

14、達(dá)與IL-6、TNF-α含量均呈正相關(guān)，（P＜0.01）。
　　結(jié)論
　　1.HPS能減輕模型動(dòng)物DCM心肌細(xì)胞和組織的損傷，減輕心肌膠原沉積和間質(zhì)纖維化，其作用機(jī)制可能與抑制心肌組織中Collagen I和Collagen III的表達(dá)有關(guān)。
　　2.通過(guò)本研究設(shè)計(jì)定制的PCR Array芯片篩選，初步發(fā)現(xiàn)了PPARγ/NF-κB及所調(diào)控的下游炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、脂肪酸代謝等64個(gè)表型基因參與了糖尿病心肌病db/db

15、小鼠心肌纖維化的病理過(guò)程。
　　3.HPS可顯著減輕模型動(dòng)物DCM心肌組織的炎癥反應(yīng)，改善心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PPARγ/NF-κB信號(hào)通路及下游相關(guān)細(xì)胞因子有關(guān)。
　　4.血糖、血脂、Collagen I、Collagen III、TNF-α、IL-6、MDA、NF-κB、IKKβ、MMP9的表達(dá)增強(qiáng)是加快模型動(dòng)物DCM心肌細(xì)胞和組織損傷、心肌組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及心肌膠原沉積和間質(zhì)纖維化的病理基礎(chǔ)，