db-db自發(fā)性糖尿病小鼠心肌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)因素研究.pdf

1、目的：應(yīng)用光鏡、電鏡、TDT-原位末端標(biāo)記(TUNEL)法和免疫組織化學(xué)方法，對db/db自發(fā)性糖尿病小鼠心肌心肌細(xì)胞凋亡率以及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，凋亡相關(guān)基因Bcl-2，Bax，小鼠心臟連接蛋白40(Cx40)及小鼠心臟連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)變化進(jìn)行了觀察，探討db/db自發(fā)性糖尿病小鼠心肌形態(tài)學(xué)改變，以期通過對小鼠心肌細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)因素的研究，為進(jìn)一步研究糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。 背景：糖尿病是一

2、種因胰島素功能不全或靶細(xì)胞對胰島素敏感降低而引起的糖類、脂類、蛋白質(zhì)紊亂的內(nèi)分泌疾病。糖尿病分為1型和2型。2型糖尿病(non-insulindependentdiabetesmellitus。NIDDM)是最常見的糖尿病類型，約占糖尿病總數(shù)的85％～90％，累及心腦血管的動脈粥樣硬化常常是造成NIDDM致死的主要原因。糖尿病也是心衰的一個重要危險因素。95％NIDDM是由于胰島素抵抗所致，胰島素抵抗是指高血糖時細(xì)胞上的胰島素受體受到抑

3、制對胰島素沒有反應(yīng)，胰島素抵抗可以造成高血壓冠心病。本實(shí)驗(yàn)選取db/db自發(fā)性糖尿病小鼠，此為非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM，2型)的良好動物模型，優(yōu)于國內(nèi)外現(xiàn)普遍采用的鏈尿菌素(STZ)破壞胰島所致的胰島素依賴型糖尿病(IDDM，1型)動物模型。 方法：引進(jìn)日本C57bl/Ksj-db/+m表型正常隱性基因小鼠，飼養(yǎng)于無菌包中，自由攝水、飲食，近親(兄妹)交配。其純合其純合子1/4后代，即db/db小鼠表現(xiàn)為肥胖和高血糖，是

4、研究非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的良好動物模型。分別選取2，4，6，8，10月齡db/db糖尿病小鼠及相應(yīng)年齡段的-db/+m正常小鼠，每組6只，4％多聚甲醛灌流固定，取心臟，后固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，然后分別進(jìn)行光鏡、電鏡、TUNEL法及免疫組織化學(xué)研究。 結(jié)果：1在db/db糖尿病小鼠，隨著病程進(jìn)展，血糖逐漸升高，心臟心肌細(xì)胞光、電鏡下出現(xiàn)一定的形態(tài)學(xué)改變，所得結(jié)果如下：1.1光鏡下db/db糖尿病小鼠心肌層心肌細(xì)胞

5、排列紊亂，心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增寬。 1.2透射電鏡下：db/db糖尿病小鼠心肌層心肌細(xì)胞肌原纖維排列紊亂，胞質(zhì)空泡化明顯，線粒體廣泛變性，表現(xiàn)為嵴排列紊亂、扭曲，甚至溶解、消失，線粒體呈空泡狀?？梢娚倭康蛲龅男募〖?xì)胞，核染色質(zhì)邊集，核膜斷裂。 1.3掃描電鏡下：db/db糖尿病小鼠心肌細(xì)胞之間間隙增大細(xì)胞直徑明顯增加，心肌連接閏盤中指狀突起變稀疏，參差不齊，突起末端膨大，閏盤臺階減少。 2心肌細(xì)胞TUNEL染

6、色及免疫組織化學(xué)結(jié)果如下： 2.1PCNA：db/db糖尿病小鼠心肌細(xì)胞免疫陽性產(chǎn)物位于心肌細(xì)胞細(xì)胞核，呈棕黃色深染。隨糖尿病病程延長，糖尿病組PCNA陽性率呈現(xiàn)明顯增高趨勢(P＜0.01)并且每年齡段糖尿病組陽性率明顯高于相應(yīng)正常對照組(P＜0.01)。 2.2凋亡：在糖尿病及正常小鼠心肌細(xì)胞均有凋亡發(fā)生。db/db糖尿病小鼠凋亡心肌細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、邊集，核固縮。隨糖尿病病程進(jìn)展，糖尿病組凋亡陽性率呈現(xiàn)明顯增高趨

7、勢(P＜0.01)并且每年齡段糖尿病組陽性率明顯高于相應(yīng)正常對照組(P＜0.01) 2.3BcL-2：在糖尿病及正常小鼠心肌細(xì)胞免疫陽性產(chǎn)物以細(xì)顆粒狀彌散分布于部分心肌細(xì)胞胞漿。db/db糖尿病小鼠隨糖尿病病程進(jìn)展，糖尿病組BcL-2表達(dá)呈遞減趨勢，而且，糖尿病組比對照組表達(dá)率低(P＜0.01)。 2.4Bax：糖尿病小鼠心肌細(xì)胞免疫陽性產(chǎn)物以細(xì)顆粒狀彌散分布于部分心肌細(xì)胞胞漿。隨糖尿病病程進(jìn)展，糖尿病組Bax表達(dá)呈增加

8、趨勢，而且，糖尿病組比對照組表達(dá)率高(P＜0.01)。2.5Cx43：Cx43陽性部位呈棕黃色顆粒，主要分布于心肌細(xì)胞閏盤處，排列整齊。與正常對照相比，db/db糖尿病組小鼠隨著發(fā)病時間的延長，Cx43陽性顆粒在心肌細(xì)胞間表達(dá)數(shù)量逐漸增加且表達(dá)部位區(qū)也發(fā)生了明顯的改變，陽性顆粒呈點(diǎn)狀、片狀不規(guī)則分布，多數(shù)分布于細(xì)胞側(cè)-側(cè)處連接，少數(shù)位于閏盤處。(6)Cx40：。Cx40陽性顆粒在糖尿病及正常小鼠心室肌細(xì)胞間閏盤處均有少量表達(dá)，少數(shù)分布在

9、細(xì)胞與細(xì)胞之間側(cè)面連接處。 結(jié)論：糖尿病性心臟病是糖尿病遠(yuǎn)期的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，一些原有的心血管疾病可能會在糖尿病出現(xiàn)時變得嚴(yán)重由此，糖尿病時，由于體內(nèi)多種因素如：肥胖，高糖血癥，并發(fā)的高血壓，高脂血癥等的影響下，心臟的功能受到影響。在本試驗(yàn)中，隨著病程的延長糖尿病小鼠明顯的肥胖，少動，反應(yīng)遲鈍.光鏡下雖然未見明顯的心肌細(xì)胞壞死，但心肌細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果及PCNABcL-2BaXCx43Cx40免疫組織化學(xué)結(jié)果的表達(dá)數(shù)量以及部

10、位區(qū)發(fā)生了明顯的改變，在心臟疾病的發(fā)病中可能發(fā)揮著重要的作用. 1.db/db糖尿病小鼠心肌中抗凋亡基因，BcL-2的減少和促凋亡基因BaX的增加都可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 2.PCNA表達(dá)增加，TUNEL標(biāo)記細(xì)胞也逐漸增多，但在2，4，6月份增值細(xì)胞百分?jǐn)?shù)大于凋亡數(shù)，而到8，10月份則凋亡的細(xì)胞數(shù)大于增值細(xì)胞數(shù)，由此可見導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的病理刺激能引起凋亡抑制因子PCNA表達(dá)增多也能引起凋亡促進(jìn)因子表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡則可能是抑制因