GLP-1-GIP-Gcg三受體激動(dòng)劑對(duì)阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知行為和腦病理特征的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　觀察 GLP-1/GIP/Gcg三受體激動(dòng)劑（Triagonist）對(duì)9月齡三轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默?。?xTg-AD）雌性小鼠認(rèn)知行為和腦病理特征的影響，并探討Triagonist發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法：
　　選用9月齡的雌性 APPSwe/PS1M146V/tauP301L3xTg-AD小鼠和野生型 C57BL/6J(C57)對(duì)照小鼠，隨機(jī)分為四組，即：C57給生理鹽水組(C57+NS

2、)、C57給藥組(C57+Triagonist)、3xTg-AD給生理鹽水組(3xTg-AD+NS)和3xTg-AD給藥組(3xTg-AD+Triagonist)。藥物組中，Triagonist用生理鹽水溶解，每天10 nmol/kg，經(jīng)腹腔注入；生理鹽水組以同樣的體積和給藥路徑注入0.9％ NaCl。持續(xù)給藥28天后開始行為學(xué)測(cè)試。（1）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)將小鼠放入曠場(chǎng)中央，讓其自由活動(dòng)5 min，用攝像頭記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡和5 min內(nèi)小鼠運(yùn)

3、動(dòng)的總距離，并計(jì)算小鼠在中間區(qū)域活動(dòng)所占時(shí)間的百分比。（2）Y迷宮實(shí)驗(yàn)將小鼠放入 Y迷宮的中央?yún)^(qū)域，讓其自由活動(dòng)8 min。記錄8 min內(nèi)小鼠的總進(jìn)臂次數(shù)和進(jìn)臂順序，計(jì)算小鼠的自發(fā)交替正確率。（3）高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)將小鼠面對(duì)閉臂放入中央?yún)^(qū)域后自由活動(dòng)10 min，記錄10 min內(nèi)小鼠的總進(jìn)臂次數(shù)、進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)，計(jì)算小鼠進(jìn)入開臂與閉臂的次數(shù)百分比。（4）經(jīng)典 Morris水迷宮和對(duì)位水迷宮將小鼠放于水迷宮中，分別進(jìn)行定位航行、

4、空間探索和可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。記錄小鼠在1 min內(nèi)的逃避潛伏期、目標(biāo)象限中游泳時(shí)間和尋找可視平臺(tái)的時(shí)間，并計(jì)算空間探索實(shí)驗(yàn)中在目標(biāo)象限游泳的時(shí)間百分比。經(jīng)典水迷宮實(shí)驗(yàn)后，將平臺(tái)放入對(duì)位象限中，再次進(jìn)行前述的定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。（5）八臂迷宮將小鼠禁食24 h后，放入八臂迷宮的中央，令其自由探索10 min，進(jìn)行適應(yīng)和測(cè)試兩個(gè)階段，記錄小鼠在測(cè)試階段進(jìn)入沒有食物臂的次數(shù)（參考記憶錯(cuò)誤）和再次進(jìn)入食物臂的次數(shù)（工作記憶錯(cuò)誤）。（6）懸尾

5、實(shí)驗(yàn)將小鼠的尾部懸掛在特定白色盒子中，將攝像頭盡可能的靠近小鼠，記錄6 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間。（7）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)將小鼠放入裝有15 cm深自來水的透明圓筒中，讓其活動(dòng)6 min，記錄小鼠后4 min的不動(dòng)時(shí)間。（8）免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，用水合氯醛腹腔麻醉，并灌注多聚甲醛，行30μm的冰凍切片后置于PBS中。加入BSA封閉，依次加入一抗、二抗和DAPI染色液，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察海馬中Aβ斑塊、磷酸化的tau

6、蛋白、突觸小泡蛋白（synaptophysin，SYP）和突觸后致密物95（postsynaptic density95，PSD95）的染色情況。（9）Western blot實(shí)驗(yàn)將行為學(xué)完成后的小鼠用水合氯醛麻醉、剪頭、取腦、分離海馬組織并提取蛋白、進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。用5%胎牛血清（BSA）封閉2 h后分別加入一抗、二抗，最后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光，運(yùn)用Alpha View SA軟件分

7、析目的蛋白（SYP、PSD95、PKAc、PKA R2、p-CREB、t-CREB）的相對(duì)灰度值。（10）ELISA實(shí)驗(yàn)將上述提取的蛋白加入到已被cAMP單克隆抗體包被的微孔板中，按照ELISA試劑盒中的方法測(cè)定cAMP的含量。
　　結(jié)果：
　?。?）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)四組小鼠在5 min內(nèi)的活動(dòng)總距離和在中央?yún)^(qū)域的時(shí)間百分比均沒有差異（P>0.05）。
　　（2）Y迷宮實(shí)驗(yàn)3xTg-AD+NS組小鼠的自發(fā)交替正確率明顯低于C5

8、7+NS組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）；Triagonist治療后，3xTg-AD小鼠的自發(fā)交替正確率明顯增高（P<0.01）；四組小鼠在8 min的總進(jìn)臂次數(shù)沒有差異（P>0.05）。
　?。?）高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)四組小鼠10 min內(nèi)進(jìn)入開臂的次數(shù)與進(jìn)入閉臂的次數(shù)百分比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　?。?）經(jīng)典Morris水迷宮和對(duì)位水迷宮四組小鼠在經(jīng)典Morris水迷宮第1-5天的定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練天

9、數(shù)的增加，逃避潛伏期均有不同程度的減少；從第二天開始，3xTg-AD+NS組小鼠的逃避潛伏期與C57+NS組相比均有明顯差異（P<0.01，P<0.001）；從第三天開始，3xTg-AD+Triagonist組小鼠的逃避潛伏期與3xTg-AD+NS組小鼠相比明顯減少（P<0.01）。第六天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，3xTg-AD+NS組小鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間百分比明顯少于C57+NS組（P<0.001）；3xTg-AD+Triagonist組小鼠

10、在目標(biāo)象限的游泳時(shí)間百分比較3xTg-AD+NS組明顯增多（P<0.001）。在可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，四組尋找平臺(tái)所用時(shí)間沒有明顯差異（P>0.05）。
　　在對(duì)位水迷宮實(shí)驗(yàn)中，第1天（即總實(shí)驗(yàn)第7天）開始3xTg-AD+NS組的逃避潛伏期與 C57+NS組相比已有明顯差異(P<0.01， P<0.001），3xTg-AD+Triagonist組與3xTg-AD+NS組相比，也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05， P<0.001）。對(duì)位水迷宮定

11、位航行試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。與 C57+NS組相比，3xTg-AD+NS組小鼠在目標(biāo)象限游泳的時(shí)間百分比明顯減少（P<0.001）；與3xTg-AD+NS組相比，3xTg-AD+Triagonist組則有所提高，且具有顯著性差異（P<0.001）。
　　（5）八臂迷宮實(shí)驗(yàn)八臂迷宮測(cè)試階段，與C57+NS組相比，3xTg-AD+NS組小鼠在10天的平均工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，具有顯著性差異（P<0.001），給予3xTg-

12、AD小鼠 Triagonist后，平均工作錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.001）；3xTg-AD+NS組小鼠在10天中的平均參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)與C57+NS相比也明顯增多（P<0.01），3xTg-AD+Triagonist組小鼠的參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)與3xTg-AD+NS小鼠相比則明顯減少（P<0.01）。
　　（6）懸尾實(shí)驗(yàn)3xTg-AD+NS組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分比較 C57+NS組小鼠明顯增加（P<0.01）；給予 Triagonist

13、后，3xTg-AD小鼠不動(dòng)時(shí)間百分比沒有明顯變化（P>0.05）。
　?。?）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)3xTg-AD+NS組小鼠與C57+NS組小鼠相比，其不動(dòng)時(shí)間百分比明顯較多（P<0.001）；而3xTg-AD+Triagonist組小鼠的不動(dòng)時(shí)間百分比與3xTg-AD+NS組相比沒有明顯差異（P>0.05）。
　　（8）免疫組化實(shí)驗(yàn)3xTg-AD+NS組小鼠海馬中的Aβ斑塊和過度磷酸化的tau蛋白陽性表達(dá)量較 C57+NS組小鼠明

14、顯增加（P<0.001）；3xTg-AD+Triagonist與3xTg-AD+NS組比較陽性表達(dá)顯著減少（P<0.001）。
　?。?）Western blot實(shí)驗(yàn)與C57+NS組相比，3xTg-AD+NS組小鼠海馬組織中的SYP、PSD95、PKAc、PKA R2以及p-CREB水平均發(fā)生了程度不等的下降（P<0.05， P<0.001）。經(jīng)Triagonist處理后，這些蛋白分子的表達(dá)水平均有不同程度的恢復(fù)（P<0.05，P

15、<0.01，P<0.001）。
　?。?0）ELISA實(shí)驗(yàn)3xTg-AD+NS組小鼠海馬組織中的 cAMP表達(dá)水平明顯低于C57+NS組(P<0.01）；經(jīng) Triagonist治療后，給藥組的3xTg-AD小鼠與3xTg-AD+NS組小鼠相比cAMP表達(dá)量明顯增高（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）9月齡3xTg-AD雌性小鼠的空間工作記憶、參考記憶、再學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知靈活性均有損害，慢性給予Triagonist

16、改善了以上認(rèn)知功能。
　　（2）9月齡3xTg-AD雌性小鼠的自主活動(dòng)和探索能力并未損害，且沒有表現(xiàn)出焦慮樣癥狀，但有明顯抑郁樣行為；Triagonist并未影響以上功能。
　?。?）給予Triagonist可以減輕9月齡3xTg-AD雌性小鼠海馬組織中Aβ斑塊聚集和tau蛋白過度磷酸化的病理特征；同時(shí)，Triagonist增加了與突觸可塑性相關(guān)的突觸前、后標(biāo)志性蛋白SYP和PSD95的表達(dá)量。
　?。?）Triago