造血祖細(xì)胞激酶HPK1對(duì)非特殊型浸潤(rùn)性乳腺癌生物學(xué)特征影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　乳腺癌是一類高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，5年發(fā)病率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，中國(guó)乳腺癌患者占全世界總數(shù)的近11％。且其發(fā)病趨勢(shì):發(fā)病率迅速上升，發(fā)病年輕化，嚴(yán)重威脅女性的健康。據(jù)WHO的組織學(xué)分類方法，乳腺癌分為浸潤(rùn)性和非浸潤(rùn)性兩大類。其中浸潤(rùn)性癌中以非特殊型浸潤(rùn)性乳腺癌(invasive ductal breast carcinoma-not otherwise specified，IDC-NOS)最常見(jiàn)，是乳腺癌最常見(jiàn)的病理類型。與

2、小葉癌或小管癌相比，缺乏豐富的特征表現(xiàn)，且其異質(zhì)性極大。IDC-NOS患者不僅療效個(gè)體化差異明顯，而且預(yù)后也不盡相同。因此，研究IDC-NOS的分子生物學(xué)特征、探索IDC-NOS相關(guān)基因及其標(biāo)志物，用于早期發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷，甚至作為靶向治療的新靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　造血祖細(xì)胞激酶(Hematopoietic progenitor kinase1，HPK1)，也稱MAP4K1，基因ID:11184，位于:19

3、q13.1-q13.4，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族(Serine/threonine kinases，SLK)的一員，屬于微管相關(guān)蛋白。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)HPK1與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HPK1可抑制肺癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移;HPK1的缺失在胰腺導(dǎo)管癌的發(fā)病過(guò)程中亦起到重要作用。提示HPK1在一些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用，但HPK1在乳腺癌中的研究目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，尤其在IDC-NOS中的表達(dá)及

4、生物學(xué)功能目前仍不明確。
　　本課題初步嘗試探討HPK1在乳腺癌中的研究，通過(guò)從臨床病例，到細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型三部分，層層遞進(jìn)，驗(yàn)證HPK1可能在IDC-NOS中的作用及其機(jī)制，為臨床上診療IDC-NOS提供新的參考。首先，在臨床IDC-NOS患者癌變組織中進(jìn)行HPK1表達(dá)的篩查、并分析其表達(dá)與預(yù)后相關(guān)指標(biāo)和患者生存期的相關(guān)性。其次，在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)HPK1低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染HPK1基

5、因，構(gòu)建HPK1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)株乳腺癌細(xì)胞系，并測(cè)定其生物學(xué)行為和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的變化。最后，通過(guò)在裸鼠內(nèi)皮下移植HPK1低表達(dá)和過(guò)表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株，構(gòu)建皮下移植瘤動(dòng)物模型，探討HPK1的表達(dá)在動(dòng)物模型體內(nèi)對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　目的：
　　1.檢測(cè)HPK1在IDC-NOS組織中的表達(dá)情況，分析HPK1表達(dá)與預(yù)后相關(guān)指標(biāo)、患者生存期的關(guān)系，明確HPK1在IDC-NOS中的研究意義。
　　2.利用慢病毒載體感染乳腺癌M

6、CF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系，篩選出HPK1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，比較HPK1基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞組（MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1）與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組（MCF-7，MCF-7-con，MDA-MB-231，MDA-MB-231-con）的生長(zhǎng)增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲能力等生物學(xué)特征的差異，檢測(cè)HPK1相關(guān)分子通路MAPK通路下游相關(guān)靶基因JNK、p53和蛋白表達(dá)量的變化，明確H

7、PK1基因?qū)DC-NOS相關(guān)細(xì)胞系的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　3.構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，檢測(cè)HPK1表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步明確HPK1的表達(dá)在動(dòng)物IDC-NOS移植瘤模型體內(nèi)的作用及相關(guān)的機(jī)制。
　　主要內(nèi)容:
　　第一部分:HPK1在IDC-NOS組織中的表達(dá)及意義
　　方法:：
　　1.于本院標(biāo)本庫(kù)中篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的IDC-NOS病例，收集相關(guān)的病例資料和對(duì)應(yīng)的石蠟標(biāo)本，采用免疫組化法(im

8、munohistochemistry，IHC)檢測(cè)HPK1蛋白在IDC-NOS組織與癌旁組織中的表達(dá)差異。
　　2.蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR)檢測(cè)ER陽(yáng)性IDC-NOS癌組織與癌旁組織中HPK1的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1.入選IDC-NOS患者148例，年齡29-78（52-±0.3）歲，隨訪時(shí)間1-

9、80（62±1）月。IDC-NOS組織中，HPK1的mRNA和蛋白陽(yáng)性率均為36.5％(54/148)，ER蛋白陽(yáng)性率為67.6％(100/148);其中HPK1蛋白在ER陽(yáng)性組中的陽(yáng)性率為28％;HPK1蛋白與ER陽(yáng)性存在明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05，r=-0.254）。PR與Her-2蛋白在IDC-NOS組織中的陽(yáng)性率分別為43.2％(64/148)和32.4％(48/148)，與HPK1均無(wú)明顯相關(guān)性（P均＞0.05）。
　　2

10、.在ER陰性組中HPK1表達(dá)與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)。在ER陽(yáng)性患者中，HPK1陽(yáng)性表達(dá)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM均是影響總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素(P＜0.05)，其中HPK1陽(yáng)性者總生存期(Overall survival，OS)更長(zhǎng)(P＜0.05)。RT-PCR顯示IDC-NOS與癌旁正常組織中HPK1mRNA水平無(wú)差異（P＞0.05），而WB顯示IDC-NOS的HPK1蛋白明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。
　　第二部分:構(gòu)建和篩選HP

11、K1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系，測(cè)定其相關(guān)生物學(xué)行為和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變
　　方法:
　　1.構(gòu)建HPK1基因慢病毒表達(dá)載體pCDH-HPK1-puro，通過(guò)克隆菌落PCR，酶切以及DNA測(cè)序分析鑒定出陽(yáng)性克隆。利用lipofectamine2000將pCDH-HPK1-puro、包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.2dvpr和pCMV-VSVG轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，獲得慢病毒Lenti-con和Lenti-HPK1的擴(kuò)增。篩選獲

12、得MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株。
　　2.MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的鑒定:利用RT-qPCR、蛋白免疫印跡(western blot)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中HPK1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.pCDH-HPK1-puro慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。慢病毒載體酶切產(chǎn)物為單一條帶，大小為2500bp左右，與預(yù)期一致，測(cè)

13、序結(jié)果與NCBI中HPK1參考序列一致，表明HPK1基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體pCDH-HPK1-puro構(gòu)建成功。
　　2.RT-qPCR和Western blot檢測(cè)HPK1表達(dá)情況，均提示在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系過(guò)表達(dá)組的HPK1的相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P＜0.05)。細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)HPK1蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況，HPK1的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中HPK1蛋白表達(dá)明顯上升，提示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　

14、第三部分:HPK1過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　方法:
　　1.通過(guò)在裸鼠腹部乳腺脂肪墊左下象限內(nèi)接種乳腺癌細(xì)胞懸液，構(gòu)建裸鼠抑制腫瘤模型，根據(jù)皮下接種細(xì)胞種類分成6組，依次為MDA-MB-231組、MDA-MB-231-con組、MDA-MB-231-HPK1組、MCF-7組、MCF-7-con組、MCF-7-HPK1組，每組15只，每只接種107個(gè)/200μl，至接種第2

15、8天每組隨機(jī)選取5只處死，解剖出移植瘤，測(cè)量移植瘤大小及重量，剩余每組10只繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，用于生存率分析。
　　2.檢測(cè)HPK1表達(dá)調(diào)節(jié)對(duì)乳腺癌體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。按時(shí)測(cè)量HPK1不同表達(dá)組裸鼠瘤體腫瘤的大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果:
　　1.裸鼠移植腫瘤模型均構(gòu)建成功。
　　2.移植裸鼠模型結(jié)果提示HPK1表達(dá)上調(diào)后MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的成瘤體積、重量均較空白組、對(duì)照組顯著性降低(P＜0.01

16、)。上調(diào)HPK1表達(dá)可抑制裸鼠瘤體的生長(zhǎng)。
　　3.上調(diào)HPK1表達(dá)可提高移植瘤裸鼠的生存率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí):MDA-MB-231組中，HPK1過(guò)表達(dá)組生存率(66％)明顯高于空白組(35.049％)和對(duì)照組(35.294％)。MCF-7組中，HPK1過(guò)表達(dá)組生存率(71.296％)明顯高于空白組(30.720％)和對(duì)照組(33.083％)。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示:在MCF-7組中及MDA-MB-231組中，HPK1表達(dá)上調(diào)

17、，JNK和P53表達(dá)均隨之上調(diào)，呈正相關(guān)趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　1.在臨床IDC-NOS病例中發(fā)現(xiàn)，HPK1基因在乳腺癌癌旁組織中表達(dá)明顯高于IDC-NOS組織，而在IDC-NOS組織中的表達(dá)量與陽(yáng)性ER呈負(fù)相關(guān)，與生存時(shí)間正相關(guān)，HPK1可能與IDC-NOS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　2.在成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HPK1的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中，上調(diào)HPK1表達(dá)可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和M