Syntenin在乳腺癌中的生物學(xué)功能及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 Syntenin在乳腺癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)情況及穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建
　　目的:檢測(cè)syntenin在乳腺癌細(xì)胞系及27對(duì)癌-癌旁組織中mRNA和蛋白的表達(dá)情況。構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)syntenin的乳腺癌細(xì)胞系和穩(wěn)定敲除syntenin的乳腺癌細(xì)胞系，為研究syntenin在乳腺癌中的生物學(xué)功能提供穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。
　　方法:(1)采用Trizol試劑提取細(xì)胞及組織的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)

2、蛋白mRNA水平;(2) Western Blot檢測(cè)細(xì)胞及組織蛋白表達(dá)水平;(3)從正常人cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出syntenin全長(zhǎng)，構(gòu)建過(guò)表達(dá)病毒質(zhì)粒，293T細(xì)胞包裝病毒后感染MDA-MB-231細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系;(4)構(gòu)建syntenin干擾表達(dá)質(zhì)粒，293T細(xì)胞包裝病毒后感染MDA-MB-231HM細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后得到穩(wěn)定細(xì)胞系;(5)實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢驗(yàn)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的過(guò)表達(dá)或

3、干擾效果。
　　結(jié)果:(1) Syntenin mRNA和蛋白水平在乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231HM中高表達(dá);(2) Syntenin mRNA和蛋白水平在乳腺癌組織中高表達(dá);(3)成功構(gòu)建syntenin穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株231-SYN，其細(xì)胞中mRNA和蛋白水平明顯高于對(duì)照細(xì)胞;(4)成功構(gòu)建syntenin穩(wěn)定干擾表達(dá)細(xì)胞株231HM-262和231HM-622，其細(xì)胞中mRNA和蛋白水平明顯低于對(duì)照細(xì)胞。
　

4、　結(jié)論:Syntenin在乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系和乳腺癌組織中高表達(dá)，說(shuō)明syntenin參與了乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可能在乳腺癌轉(zhuǎn)移中起重要作用。成功構(gòu)建syntenin穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞系，為在乳腺癌細(xì)胞系中研究其生物學(xué)功能提供了理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。
　　第二部分 Syntenin對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其相關(guān)機(jī)制研究
　　目的:研究syntenin在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期、生長(zhǎng)增殖和遷移侵襲的影響，并初步探討其

5、作用機(jī)制。
　　方法:(1)采用流式細(xì)胞技術(shù)研究syntenin對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響;(2)采用CCK8生長(zhǎng)曲線研究syntenin對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響;(3)應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)來(lái)研究syntenin對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響;(4)運(yùn)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究syntenin對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外侵襲運(yùn)動(dòng)能力的影響;(5) Western blot研究syntenin對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響;(

6、6)采用Westernblot及Integrinβ1功能抑制抗體研究Integrinβ1在ERK MAPK信號(hào)通路激活中的作用;(7)采用ERK1/2特異型抑制劑U0126研究ERK1/2激活在syntenin過(guò)表達(dá)引起的乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。
　　結(jié)果:(1)流式細(xì)胞結(jié)果表明syntenin過(guò)表達(dá)或者敲除相對(duì)于對(duì)照組，其細(xì)胞周期中各個(gè)時(shí)期的比例沒(méi)有變化;(2) CCK8增殖實(shí)驗(yàn)表明syntenin蛋白表達(dá)的改變對(duì)乳腺癌細(xì)

7、胞增殖能力沒(méi)有影響;(3)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，syntenin過(guò)表達(dá)細(xì)胞組相對(duì)于對(duì)照組，其體外遷移能力明顯增強(qiáng)，相反，syntenin敲除細(xì)胞組相對(duì)于對(duì)照組，其體外遷移能力明顯減弱;(4)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明syntenin過(guò)表達(dá)細(xì)胞，其體外侵襲能力顯著增強(qiáng)，而敲除syntenin后，其體外侵襲能力顯著降低;(5) Syntenin過(guò)表達(dá)引起ERK1/2的激活，但是對(duì)JNK和p38沒(méi)有影響;(6)

8、 Syntenin過(guò)表達(dá)引起活性Integrinβ1的表達(dá)升高，且Integrinβ1的激活影響ERK1/2的激活;(7)與對(duì)照組相比，使用了ERK1/2抑制劑U0126預(yù)處理的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株231-SYN，其細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯被抑制。
　　結(jié)論:Syntenin在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期和增殖能力沒(méi)有影響，但是影響乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Integrinβ1和ERK1/2信號(hào)通路的激活在syntenin過(guò)表達(dá)引起的乳腺癌細(xì)胞遷

9、移和侵襲中是必須的。
　　第三部分 Syntenin對(duì)裸鼠成瘤和轉(zhuǎn)移的影響以及與臨床參數(shù)的關(guān)系
　　目的:研究syntenin表達(dá)在裸鼠模型中對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及其在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，闡明人乳腺癌組織中syntenin的表達(dá)與臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:(1)建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，從體內(nèi)角度研究syntenin表達(dá)對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響;(2)采用HE染色觀察肺轉(zhuǎn)移情況;(3)采用IHC

10、方法標(biāo)記移植瘤內(nèi)新生血管(CD31)，計(jì)數(shù)微血管密度(microvessel density，MVD);(4)采用IHC方法在239例人乳腺癌組織標(biāo)本中研究syntenin的表達(dá)情況;(5)對(duì)syntenin在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，分兩種類(lèi)型統(tǒng)計(jì)，分別是syntenin陽(yáng)性表達(dá)和syntenin陰性表達(dá)，采用Spearman's相關(guān)分析研究其與乳腺癌臨床指標(biāo)的關(guān)系;(6)采用Kaplan-Meier生存分析研究syntenin的表達(dá)與

11、患者無(wú)病生存率及總生存率的關(guān)系。(7)采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析研究syntenin是否是一個(gè)影響浸潤(rùn)性乳腺癌患者總生存率和無(wú)病生存的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　結(jié)果:(1) Syntenin過(guò)表達(dá)能促進(jìn)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)而syntenin下調(diào)可以抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng);(2) Syntenin過(guò)表達(dá)能促進(jìn)裸鼠移植瘤的肺轉(zhuǎn)移，相反syntenin干擾表達(dá)能抑制裸鼠肺轉(zhuǎn)移的形成;(3) Syntenin過(guò)表達(dá)的裸鼠移植瘤中微血管密度明顯高于對(duì)照

12、組，而syntenin下調(diào)表達(dá)形成的裸鼠移植瘤中，其微血管密度相對(duì)于對(duì)照組明顯降低;(4)對(duì)乳腺癌組織的IHC研究結(jié)果顯示，在239例乳腺癌患者中，有88例患者為syntenin陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)的比例為36.82％，syntenin陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián);(5) Syntenin陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存率和無(wú)病生存率較低;(6)多因素分析結(jié)果顯示，Syntenin是影響浸潤(rùn)性乳腺癌患者總生存率和無(wú)病生存的一個(gè)獨(dú)