LIN28A在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)調(diào)控及其功能機(jī)制的研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率以每年3％的速度遞增，成為威脅女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。LIN28作為高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在多種腫瘤中存在廣泛的異位表達(dá)，且有研究發(fā)現(xiàn)，LIN28過(guò)度表達(dá)是腫瘤患者不良預(yù)后的強(qiáng)大預(yù)測(cè)指標(biāo)。本文通過(guò)研究 LIN28A在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)以及LIN28A對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，探討LIN28

2、A誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生EMT以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1首先利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)浸潤(rùn)性乳腺癌組織中LIN28A、OCT4、E-cadherin和Vimeatin進(jìn)行檢測(cè)，明確它們的表達(dá)情況，其次利用免疫組織化學(xué)法，分析LIN28A的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，以期明確在浸潤(rùn)性乳腺癌中 LIN28A與 EMT相關(guān)因子及 OCT4的關(guān)系，最后通過(guò)TUNNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)石蠟組織切片中細(xì)胞凋亡的情況，探究

3、 LIN28A對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　2體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) LIN28A的 MCF-7細(xì)胞系，研究LIN28A對(duì)乳腺細(xì)胞特性的影響，其中包括流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率， Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況。最后，通過(guò)Real-time和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況，明確乳腺癌細(xì)胞中LIN28A對(duì)癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。

4、>　　結(jié)果：1 Real-time實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中LIN28A、OCT4、Vimeatin高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)。并且LIN28A與OCT4表達(dá)正相關(guān)（R=0.332，P＜0.05），Vimeatin表達(dá)正相關(guān)（R=0.38， P＜0.05），與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)（R=-0.34，P＜0.05），E-cadherin與Vimeatin表達(dá)也成負(fù)相關(guān)（R=-0.353，P＜0.05

5、）；2免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，LIN28A表達(dá)與浸潤(rùn)性乳腺癌腫瘤的大小、病理分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。并且 LIN28A與OCT4表達(dá)正相關(guān)（R=0.423，P＜0.05），與Vimeatin表達(dá)正相關(guān)（R=0.364， P＜0.05），與 E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)（R=-0.533，P＜0.05），E-cadherin與Vimeatin表達(dá)也成負(fù)相關(guān)（R=-0.453，P＜0.05）。

6、Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析表明，患者低LIN28A表達(dá)水平存活顯著長(zhǎng)于那些高LIN28A表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），表明，在浸潤(rùn)性乳腺癌中，LIN28A與患者的不良臨床預(yù)后相關(guān)；3 TUNNEL實(shí)驗(yàn)顯示，高表達(dá)LIN28A的乳腺癌組織中，細(xì)胞凋亡減少；4 Puromycin篩選出穩(wěn)定表達(dá) LIN28A的MCF-7細(xì)胞株，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)感染率，用400μl病毒液感染293T細(xì)胞，control-pSBbi-G

7、P和LIN28A-pSBbi-GP的感染效率為13.1%、12.6%。800μl病毒液感染293T細(xì)胞，control-pSBbi-GP和LIN28A-pSBbi-GP的感染效率為20.1%、19.5%。由于轉(zhuǎn)染效率太低，故用病毒原液感染MCF-7細(xì)胞， control-pSBbi-GP和 LIN28A-pSBbi-GP的感染效率為29.6%、24.8%。；5用Real-time和Western-blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)后LIN28A的表達(dá)情況

8、，首先Real-time檢測(cè)LIN28A和let-7a的表達(dá)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與control-pSBbi-GP和parental相比，LIN28A-pSBbi-GP中LIN28A mRNA表達(dá)升高，而let-7a mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。隨后通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LIN28A蛋白水平的表達(dá)，同樣是與control-pSBbi-GP和parental相比，LIN28A-pSBbi-GP中LIN28A表達(dá)升高（

9、P＜0.05）；6克隆形成實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞增殖的變化，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，parental組、control-pSBbi-GP組和 LIN28A-pSBbi-GP組的克隆數(shù)分別為38.20±2.02、44.55±2.67和102.65±9.87，與parental組和control-pSBbi-GP組相比，LIN28A-pSBbi-GP克隆數(shù)顯著增加（P＜0.05），control-pSBbi-GP組與 parental組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、（P＞0.05），提示過(guò)表達(dá)LIN28A基因可以促進(jìn)細(xì)胞增殖；7 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中，與 parental組和control-pSBbi-GP組相比，LIN28A-pSBbi-GP組遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），提示過(guò)表達(dá)LIN28A基因可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；8 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示，與parental組和control-pSBbi-GP組相比，

11、LIN28A-pSBbi-GP組細(xì)胞早期凋亡率顯著降低（P＜0.05），并且，過(guò)表達(dá)LIN28A基因后，G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多；9 Real-time和 Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與 parental組和control-pSBbi-GP組相比，LIN28A-pSBbi-GP組MCF-7細(xì)胞Snail和Slug表達(dá)上調(diào)，CyclinD1和eIF4E表達(dá)上調(diào)，Bcl-XL表達(dá)上調(diào)，這表明過(guò)表達(dá)LIN28A可能通過(guò)抑制let

12、-7誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡；10進(jìn)一步研究LIN28A與OCT4的關(guān)系，通過(guò)Real-time和Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)LIN28A后，OCT4表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)減少，Vimtern表達(dá)增加，提示，LIN28A也可以通過(guò)誘導(dǎo)OCT4的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌EMT的進(jìn)程。
　　結(jié)論：
　　1 LIN28A在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)與 E-cadherin的表達(dá)負(fù)相關(guān)與Vimentin的表達(dá)正相關(guān)

13、，提示LIN28A可能通過(guò)EMT促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并且LIN28A高表達(dá)是患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。
　　2通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在 MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá) LIN28A，我們發(fā)現(xiàn)LIN28A過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，使細(xì)胞阻滯在S期，同時(shí)，通過(guò)檢測(cè) let-7相關(guān)的靶基因，發(fā)現(xiàn) LIN28A可以通過(guò)LIN28/Let-7/HMGA2/Slug、Snail/E-cadherin和LIN28/let-7/BCL