TGF-β1對(duì)乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞特征作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　研究目的:
　　研究 TGF-β1對(duì)乳腺癌細(xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)、對(duì)乳腺癌干細(xì)胞富集、自我更新、轉(zhuǎn)移侵襲、化療耐藥等相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響及對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期、侵襲及誘導(dǎo)耐藥等方面的作用;鹽霉素對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的作用及其逆轉(zhuǎn)表阿霉素及多西紫杉醇耐藥的作用。
　　研究方法:
　　取用MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株乳腺癌細(xì)胞株,運(yùn)用流式細(xì)胞儀法

2、檢測(cè)各株細(xì)胞中ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞群比例及細(xì)胞周期,實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-RT-PCR),Western blot法檢測(cè) p21的表達(dá);同法比較 TGF-β1作用四株細(xì)胞后ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞群、細(xì)胞周期、p21基因及蛋白水平表達(dá)差異;乳腺細(xì)胞球培養(yǎng)法富集乳腺癌干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè) TGF-β1在富集乳腺癌干細(xì)胞中的作用, Q-RT-PCR、Western blot法檢測(cè)各處理因素的乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥、周期調(diào)控、細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)

3、因子 SATB1、MMP1、P21、Vimentin、E-cadherin基因及蛋白水平表達(dá)差異;Transwell侵襲小室法檢測(cè)各處理因素前后乳腺癌細(xì)胞侵襲能力變化;CCK-8法檢測(cè)各處理因素前后乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物表阿霉素、多西紫杉醇、鹽霉素藥物敏感性差異;將鹽霉素與表阿霉素、多西紫杉醇兩藥或三藥聯(lián)合作用各處理因素乳腺癌細(xì)胞,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,檢測(cè)鹽霉素在逆轉(zhuǎn)表阿霉素及多西紫杉醇耐藥方面的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:<

4、br>　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示 MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株細(xì)胞中ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞群比例分別為1.49％、8.38％、1.53％、4.23％,以 MCF7/ADM細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞群含量最高。加入 TGF-β1培養(yǎng)后 MCF7、MCF7/ADM、SKBR3三株細(xì)胞株(ALDH1不宜做為 MDA-MB-231乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物)中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞側(cè)群比例平均分別為3.83％、10.06

5、％、6.32％。加入 TGF-β1培養(yǎng)后 MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)分別較未加入TGF-β1培養(yǎng)細(xì)胞顯著上調(diào),分別上調(diào)2倍、1.7倍、1.5倍和1.2倍(n=3,p<0.05)。加入 TGF-β1培養(yǎng)后 MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株細(xì)胞表現(xiàn)出G1期阻滯(n=3,p<0.05)。TGF-β1上調(diào) p21、SATB1、MMP1、Viment

6、in的表達(dá),下調(diào) E-cadherin的表達(dá);TGF-β1使細(xì)胞出現(xiàn)進(jìn)一步的G0/G1期阻阻滯(p<0.001)。TGF-β1可使細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力,細(xì)胞球形成率顯著升高(p<0.001);TGF-β1可增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力(p<0.05)。表阿霉素(EPI)、多西紫杉(DOX)對(duì) MCF7的IC50值分別為:0.4ug/ml、0.2ug/ml;對(duì) MCF7/ADM的IC50值分別為:20ug/ml、0.6ug/ml;對(duì) SC細(xì)胞的

7、IC50值分別為:50ug/ml、1ug/ml;對(duì) SC-T細(xì)胞的IC50值分別為:120ug/ml、10ug/ml。SC及SC-T細(xì)胞對(duì) EPI、DOX體現(xiàn)出顯著耐藥性。鹽霉素(SAL)對(duì) MCF7/ADM、SC、SC-T三組細(xì)胞的IC50值分別為:3±0.2ug/ml、8±0.5ug/ml、9±0.2umol/ml。 EPI、DOX及SAL三種藥物單獨(dú)作用于 MCF7/ADM、SC、SC-T細(xì)胞時(shí),乳腺癌干細(xì)胞體現(xiàn)出明顯的藥物抵抗性

8、,在 TGF-β1作用后藥物抵抗更為明顯,p<0.01;在兩藥聯(lián)用方面,DOX和SAL聯(lián)用的方式顯著優(yōu)于其他組合,p<0.01。EPI、DOX、SAL三藥聯(lián)用時(shí),三組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯差異,p>0.1。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.TGF-β1可以增加乳腺癌細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞池,提高細(xì)胞周期調(diào)控因子 p21的表達(dá),使細(xì)胞出現(xiàn) G0/G1期阻滯。
　　2.TGF-β1可以上調(diào)自我更新和侵襲能力相關(guān)的p21、MMP、SATB1

9、、Vimentin基因水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　3.TGF-β1可以有效富集乳腺癌干細(xì)胞。促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物 ALDH1的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞自我更新、侵襲能力,誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥。
　　4.針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞殺傷的藥物鹽霉素可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)表阿霉素及多西紫杉醇的敏感性,三藥聯(lián)合使用時(shí)在中等劑量即可有效殺傷乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌干細(xì)胞。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 乳腺癌細(xì)胞系中ALDH

10、1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞比例及p21表達(dá)的研究
　　目的:檢測(cè)乳腺癌 MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞側(cè)群所占比例,及各細(xì)胞株中p21 mRNA表達(dá),四株細(xì)胞株中G0/G1期細(xì)胞比例。
　　方法:用ALDEFLOUR regent kit標(biāo)記四株細(xì)胞株,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞側(cè)群比例(n=3)。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-RT-PCR)檢測(cè)四株細(xì)

11、胞株內(nèi) p21 mRNA的表達(dá)(n=3)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)四株細(xì)胞周期 G0/G1期細(xì)胞比例(n=3)。相關(guān)性分析 p21 mRNA與乳腺癌細(xì)胞株中ALDH1標(biāo)記物表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞側(cè)群比例分別為1.49％、8.38％、1.53％、4.23％(n=3,p<0.05);上述四組細(xì)胞株 G0/G1期細(xì)胞比例分別為67.93％、41

12、.70％、43.6％、39.31％;四株細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)以 MCF7/ADM表達(dá)最高,其次為 SKBR3,MCF7表達(dá)最低(n=3, p<0.01)。MCF7、MCF7/ADM、SKBR3三株細(xì)胞的p21 mRNA表達(dá)水平與 ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞比例作相關(guān)性分析顯示 p21 mRNA表達(dá)水平與 ALDH1標(biāo)記物陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞比例呈強(qiáng)正相關(guān)。
　　結(jié)論:四株乳腺癌細(xì)胞株中,以 MCF7/ADM細(xì)胞株內(nèi) ALDH1

13、陽(yáng)性細(xì)胞比例最高,即MCF7/ADM細(xì)胞株中含有較高比例的乳腺癌干細(xì)胞。檢測(cè)四株細(xì)胞 G0/G1期細(xì)胞比例及細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子 p21均以 MCF7/ADM表達(dá)最高。p21 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物 ALDH1的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)性。
　　第二部分 TGF-β1對(duì)乳腺癌細(xì)胞 ALDH1、p21mRNA的表達(dá)及細(xì)胞周期的作用
　　目的:檢測(cè) TGF-β1對(duì)乳腺癌 MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-2

14、31、SKBR3四株細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞比例、p21 mRNA表達(dá)及細(xì)胞周期的影響。檢測(cè) TGF-β1對(duì)乳腺癌干細(xì)胞富集的影響。
　　方法:在各細(xì)胞株中加入濃度為10ng/ml的TGF-β1培養(yǎng)各細(xì)胞株(9天),采用ALDEFLOUR regent kit標(biāo)記四株細(xì)胞株,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞側(cè)群比例和G0/G1期細(xì)胞比例(n=3)。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-RT-PCR)檢測(cè)四

15、株細(xì)胞株內(nèi) p21 mRNA和蛋白的表達(dá)(n=3)。以乳腺細(xì)胞球培養(yǎng)法富集 MCF7/ADM中乳腺癌干細(xì)胞,以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)加入或不加入 TGF-β1(10ng/ml)對(duì) ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞比例及細(xì)胞周期的影響(n=3)。
　　結(jié)果:加入 TGF-β1培養(yǎng)后 MCF7、MCF7/ADM、SKBR3三株細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞側(cè)群比例平均分別為3.83％、10.06％、6.32％,與不加 TGF-β1培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞相比

16、,ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯提高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3,p<0.05);加入 TGF-β1培養(yǎng)后 MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株細(xì)胞表現(xiàn)出 G1期阻滯(n=3,p<0.05);加入 TGF-β1培養(yǎng)后 MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)分別較未加入 TGF-β1培養(yǎng)細(xì)胞顯著上調(diào),分別上調(diào)2倍、1.7倍、1.5倍和1.2倍(n=3,p<0.05)。

17、乳腺細(xì)胞球培養(yǎng)法富集的細(xì)胞球(標(biāo)記為 SC)中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞側(cè)群比例平均為15.74％,加入 TGF-β1培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞球(標(biāo)記為 SC-T)中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞側(cè)群比例平均為25.17％。 SC-T中p21 mRNA表達(dá)水平和G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于 SC細(xì)胞,n=3, p<0.05。
　　結(jié)論:TGF-β1可提高 MCF7、MCF7/ADM、SKBR3三株乳腺癌細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性側(cè)群比例及p21

18、mRNA表達(dá)水平,同時(shí)亦可增加 G0/G1期細(xì)胞比例。TGF-β1可更有效地富集乳腺癌干細(xì)胞。
　　第三部分 TGF-β1對(duì)乳腺癌干細(xì)胞特性的影響
　　目的:檢測(cè) TGF-β1對(duì) MCF7/ADM中乳腺癌干細(xì)胞中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞富集、自我更新、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥的影響。研究 TGF-β1對(duì)乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記特表達(dá)的影響,乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)性。
　　方法:以乳腺癌干細(xì)

19、胞球培養(yǎng)法富集耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞系 MCF7/ADM中的乳腺癌干細(xì)胞(標(biāo)記為 SC),同法加入 TGF-β1所富集乳腺癌干細(xì)胞(標(biāo)記為 SC-T),采用實(shí)時(shí)定量熒光 PCR及Western blot法檢測(cè) p21、MMP1、SATB1、vimentin、E-cadherin表達(dá)差異;Transwell侵襲小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的差異;細(xì)胞球克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力的差異;采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞株中ALDH1陽(yáng)性乳腺癌干細(xì)胞比例

20、和G0/G1期細(xì)胞比例(n=3)。采用CCK8法檢測(cè)藥物敏感性差異及耐藥指數(shù)。
　　結(jié)果:TGF-β1上調(diào) p21、SATB1、MMP1、Vimentin的表達(dá),下調(diào) E-cadherin的表達(dá)。TGF-β1可使細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力,細(xì)胞球形成率顯著升高(p<0.001),使細(xì)胞出現(xiàn)進(jìn)一步的G0/G1期阻阻滯(p<0.001);TGF-β1可增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力(p<0.05)。表阿霉素、多西紫杉對(duì) MCF7的IC50值分別為:

21、0.4ug/ml、0.2ug/ml;對(duì) MCF7/ADM的IC50值分別為:20ug/ml、0.6ug/ml;對(duì) SC細(xì)胞的IC50值分別為:50ug/ml、1ug/ml;對(duì) SC-T細(xì)胞的IC50值分別為:120ug/ml、10ug/ml。SC及SC-T細(xì)胞對(duì)表阿霉素、多西紫杉體現(xiàn)出顯著耐藥性.
　　結(jié)論:TGF-β1可以有效富集乳腺癌干細(xì)胞。TGF-β1可使乳腺癌干細(xì)胞自我更新及侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),誘導(dǎo)化療耐藥,促使乳腺癌干細(xì)胞

22、標(biāo)記物穩(wěn)定表達(dá),促使乳腺癌干細(xì)胞特性的獲得,促進(jìn)乳腺癌疾病進(jìn)展。
　　第四部分鹽霉素對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的作用及對(duì)化療增敏的研究
　　目的:檢測(cè)鹽霉素對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的殺傷作用。研究鹽霉素與表柔比星及多西紫杉醇聯(lián)用對(duì)乳腺癌干細(xì)胞殺傷作用,探討鹽霉素在增加乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的作用。
　　方法:以乳腺癌干細(xì)胞球培養(yǎng)法富集耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞系 MCF7/ADM中的乳腺癌干細(xì)胞(標(biāo)記為 SC),同法加入 TGF-β1所富集乳腺癌干細(xì)

23、胞(標(biāo)記為 SC-T),采用CCK8法檢測(cè) MCF7/ADM、SC、SC-T三組細(xì)胞對(duì)鹽霉素(SAL)的IC50值,采用CCK8法檢測(cè)表阿霉素(EPI)、多西紫杉醇(DOX)、鹽霉素(SAL)單藥或聯(lián)合用藥時(shí)對(duì) MCF7/ADM、SC、SC-T的生長(zhǎng)抑制作用(n=3)。
　　結(jié)果:鹽霉素對(duì) MCF7/ADM、SC、SC-T三組細(xì)胞 IC50值分別為:3±0.2ug/ml、8±0.5ug/ml、9±0.2ug/ml。 EPI、DOX

24、及SAL三種藥物單獨(dú)作用于 MCF7/ADM、SC、SC-T細(xì)胞時(shí),乳腺癌干細(xì)胞體現(xiàn)出明顯的藥物抵抗性,在 TGF-β1作用后藥物抵抗更為明顯,p<0.01;在兩藥聯(lián)用方面，DOX和SAL聯(lián)用的方式顯著優(yōu)于其他組合，p<0.01。EPI、DOX,SAL三藥聯(lián)用時(shí)，三組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯差異，p>0.1.
　　結(jié)論：針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞殺傷的藥物鹽霉素可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)表阿霉素及多西紫杉醇的敏感性，三藥聯(lián)合使用時(shí)在中等劑量即可有殺作