Gli對食管腺癌OE19細胞生物學作用的體外實驗研究.pdf

1、目的：目前對食管癌癥患者的治療多采取以手術、放化療等為主的綜合治療，但是化療藥物療效較差、毒副作用大，治療效果不甚理想。近年來隨著分子腫瘤學的快速發(fā)展，腫瘤的靶向治療越來越得到人們的重視。Hedgehog（Hh）信號通路在胚胎期調(diào)控多種細胞的分化和生長，對維持成熟器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及人類多種惡性腫瘤的發(fā)展及轉移密切相關。Gli作為 Hh信號通路下游調(diào)控中心，其異常激活可以啟動下游多種與腫瘤相關基因的轉錄。許多研究表明Gli基因通過多種機制可

2、誘導多種癌癥的發(fā)生，并且與多種癌癥侵襲轉移密切相關。近年來基因治療作為一種全新的治療模式顯示出良好的應用前景，其中RNA干擾被公認為是細胞調(diào)節(jié)基因表達的關鍵機制。既往針對食管腺癌Hh通路的研究多集中在上游靶點Smo，針對Hh通路下游核心靶點Gli表達調(diào)控研究極少，所以本研究通過siRNA抑制Gli在食管腺癌OE19細胞中的表達，探討了Gli表達下調(diào)對食管腺癌細胞生長和侵襲能力的影響及可能的分子機制，旨在為臨床上食管腺癌的靶向治療提供新思

3、路。
　　方法：將不同濃度（50nmol/L和100nmol/L）Gli1、Gli2siRNA和空白對照siRNA轉染食管腺癌OE19細胞48h，實時熒光定量PCR法檢測食管腺癌OE19細胞Gli1和Gli2mRNA表達水平；免疫印跡試驗檢測siRNA轉染OE19細胞后Gli1、Gli2、Cyclin D1、Snail和E-cadherin蛋白表達水平；流式細胞術檢測OE19細胞增殖和細胞周期分布；Transwell侵襲實驗觀察s

4、iRNA抑制Gli表達后對食管腺癌細胞侵襲轉移能力的影響。
　　結果：
　　1食管腺癌OE19細胞Gli1mRNA和Gli2mRNA的表達
　　將Gli1和Gli2siRNA組檢測數(shù)據(jù)與control組（空白對照siRNA）相比較，Gli1siRNA中siRNA1mRNA和siRNA2mRNA較control組均顯著降低，三組方差分析，差異比較有統(tǒng)計學意義（F=113.134, P=0.000）， siRNA1mRNA

5、與control比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），siRNA2mRNA與control比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）， siRNA1mRNA與siRNA2mRNA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.033）；Gli2siRNA中siRNA1mRNA和siRNA2mRNA較control組均顯著降低，三組方差分析，差異比較有統(tǒng)計學意義（F=262.329, P=0.000），siRNA1mRNA與control比較，差異有統(tǒng)

6、計學意義（P=0.000），siRNA2mRNA與control比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），siRNA1mRNA與siRNA2mRNA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021）。
　　2食管腺癌OE19細胞中蛋白表達
　　Western blot結果表明：Gli1蛋白表達各組間有顯著性差異（F=1583.808，P=0.000）；Gli2蛋白表達各組間有顯著性差異（F=529.058， P=0.000）；Snai

7、l蛋白表達各組間有顯著性差異（F=1201.971，P=0.000）；E-cadherin蛋白表達各組間有顯著性差異（F=1742.273，P=0.000）CyclinD1蛋白表達各組間有顯著性差異（F=677.638，P=0.000）；
　　其中經(jīng)SiRNA1處理細胞后Gli1（P=0.000）、Gli2（P=0.000）、Snail（P=0.000）和CyclinD1（P=0.000）蛋白表達均顯著低于control組， E-

8、cadherin（P=0.000）蛋白表達高于control組，差異均有統(tǒng)計學意義；與control組相比SiRNA2處理組Gli1（P=0.000）、Gli2（P=0.000）、Snail（P=0.000）和CyclinD1（P=0.000）蛋白表達均顯著降低， E-cadherin（P=0.000）蛋白表達增高，差異均有統(tǒng)計學意義。經(jīng)SiRNA2處理細胞后Gli1（P=0.000）、Gli2（P=0.000）、Snail（P=0.0

9、00）和CyclinD1（P=0.000）蛋白表達均低于SiRNA1組，E-cadherin（P=0.000）蛋白表達高于SiRNA1組，差異均有統(tǒng)計學意義；
　　3細胞周期研究結果
　　G0/G1期 Control組細胞為（42.62±2.25）％， siRNA1組細胞為（58.68±2.43）%、SiRNA2組細胞為（67.39±3.21）%，三組比較方差分析結果(F=66.804，p=0.000)，SiRNA1組顯著高

10、于Control組，差異比較有統(tǒng)計學意義（P=0.000），SiRNA2組高于Control組，差異比較有統(tǒng)計學意義（P=0.000），SiRNA2組顯著高于SiRNA1組（P=0.000）；S期Control組細胞為（45.38±2.02）%，siRNA1組細胞為（39.51±2.72）%、SiRNA2組細胞為（28.45±2.04）%，三組比較方差分析結果(F=42.525，P=0.000)， SiRNA1組低于Control組（P

11、=0.032）， SiRNA2組低于Control組（P=0.000），SiRNA2組顯著低于SiRNA1組（P=0.000），差異比較有統(tǒng)計學意義。G2/M期Control組細胞為（6.00±1.96）%，siRNA1組細胞為（5.81±2.01）%、SiRNA2組細胞為（5.16±2.34）%，三組比較方差分析結果(F=0.131，P=0.879)，差異比較無統(tǒng)計學意義。
　　4細胞侵襲能力實驗結果
　　各組間比較差別有

12、統(tǒng)計學意義（F=797.079，P=0.000）：與Control組穿膜細胞相對數(shù)表達量(1.00±0.01)比較，SiRNA1組穿膜細胞數(shù)相對表達量(0.72±0.01)明顯減少（P=0.000），SiRNA2組穿膜細胞數(shù)相對表達量(0.33±0.01)較control明顯減少（P=0.000）。SiRNA2組穿膜細胞數(shù)相對表達量(0.33±0.01)較SiRNA1(0.72±0.01)組明顯減少（P=0.000）。
　　結論：

13、
　　1 siRNA可以明顯抑制食管腺癌OE19細胞中GlimRNA的表達，并且具有劑量依賴性。
　　2 Hedgehog通路與食管腺癌生長增殖和上皮-間質轉化(EMT)過程存在密切關系，當抑制Hedgehog通路時，其生長增殖和EMT過程被明顯抑制。
　　3 Gli在食管腺癌的生長轉移中具有重要的作用， SiRNA通過下調(diào)Gli1和Gli2表達可抑制食管腺癌細胞周期分布和EMT能力，這可能與Gli調(diào)控CyclinD1