RIP1激酶參與缺血性腦中風(fēng)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕的形成.pdf

1、目的：
　　研究necroptosis死亡的關(guān)鍵激酶RIP1K（receptor interaction protein1 kinase,RIP1K）在缺血性腦中風(fēng)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成中的作用，并研究其作用機制是否與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的VEGFD-VEGFR3信號通路有關(guān)。
　　方法：
　　采用大鼠短暫性大腦中動脈阻塞（transient middle cerebral artery occlusion,

2、tMCAO）方法，建立大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕模型。模型前5天側(cè)腦室注射慢病毒沉默RIP1K基因，以腦萎縮體積、行為學(xué)癥狀等指標(biāo)評價大鼠腦中風(fēng)后期的神經(jīng)功能恢復(fù)情況。采用原代培養(yǎng)的新生大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation,OGD）再灌注的方法，建立體外星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成的細(xì)胞模型。星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元co-culture法檢測RIP1K基因沉默對神經(jīng)元軸突的影響。LDH方法

3、檢測OGD再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率。免疫熒光法、western blot法檢測體內(nèi)體外缺糖缺氧再灌注對星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成的標(biāo)志蛋白GFAP、neurocan以及phosphacan表達(dá)情況。Western blot法及免疫熒光法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞RIP1K、VEGFD、VEGFR3表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　術(shù)前5天給予RIP1K基因沉默病毒可有效減少tMCAO誘導(dǎo)的大鼠膠質(zhì)瘢痕的形成，減少腦中風(fēng)2

4、8天后腦萎縮體積（P＜0.01）,及改善行為學(xué)癥狀（P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示：tMCAO后皮層缺血區(qū)膠質(zhì)瘢痕標(biāo)志蛋白GFAP、neurocan、phosphacan以及RIP1K表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。在RIP1K基因沉默后，免疫組化顯示sh RIP1K可抑制皮層缺血區(qū)膠質(zhì)瘢痕標(biāo)志蛋白 GFAP、neurocan、表達(dá)上調(diào)以及VEGFD、VEGFR3表達(dá)的上調(diào)（P＜0.01）。在星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪再灌注的體外

5、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕模型，Western Blot結(jié)果顯示：星形膠質(zhì)細(xì)胞在OGD再灌注后，膠質(zhì)瘢痕的標(biāo)志蛋白GFAP、neurocan、phosphacan以及RIP1K、VEGFD、VEGFR3表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），Elisa結(jié)果顯示：在星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/再灌注后，星形膠質(zhì)細(xì)胞以及培養(yǎng)基中 VEGFD表達(dá)較正常組均增加。RIP1K基因沉默可對抗OGD/再灌注引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、neurocan、phosphacan

6、、RIP1K表達(dá)變化，并減少VEGFD、VEGFR3表達(dá)的上調(diào)（P＜0.01）。在星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/再灌注膠質(zhì)瘢痕模型與神經(jīng)元共培養(yǎng)系統(tǒng)中，LDH結(jié)果顯示：RIP1K基因沉默可以抑制OGD/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率（P＜0.01），促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延伸（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.抑制RIP1K可以促進(jìn)缺血性腦中風(fēng)后期神經(jīng)功能的恢復(fù)，其作用可能與RIP1K基因沉默抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕的形成有關(guān)。