星形膠質(zhì)細胞來源的IL-17A對缺血性腦卒中神經(jīng)再生和功能恢復的影響及機制研究.pdf

1、第一部分 IL-17A在缺血性腦卒中（CIS）恢復期的表達變化以及神經(jīng)再生和功能恢復的影響
　　目的：確定CIS后IL-17A的時間與空間表達趨勢，以及明確IL-17A是否可促進CIS后神經(jīng)再生與功能恢復。
　　方法：成年雄性IL-17A敲除（IL-17A knock-out，il-17a-/-）或野生型（wide-type，WT）小鼠大腦中動脈栓塞，缺血60分鐘后再灌注。野生型小鼠從CIS后14天開始，連續(xù)14天經(jīng)鼻腔給予

2、重組白介素17A蛋白（recombinant IL-17A，rIL-17A）或溶劑對照（vehicle），或者經(jīng)側(cè)腦室給予小鼠IL-17A中和抗體（anti-IL-17A mAb）或IgG1同型對照抗體。CIS后27天腹腔注射BrdU，間隔8個小時，16小時后灌注取材檢測祖細胞增殖活性。CIS后7天腹腔注射BrdU，間隔8個小時候再次注射一次，連續(xù)注射7天，35天灌注取材檢測祖細胞壽命。CIS后1、3、7、14、21、28、42或70天

3、免疫印跡和實時定量PCR檢測缺血側(cè)大腦半球IL-17A的表達。CIS后7、14、21或28天免疫熒光和免疫印跡檢測腦室下區(qū)（subventricularzone，SVZ）和海馬區(qū)IL-17A的表達。CIS后28或35天免疫細胞化學染色溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU），Ki67，磷酸化組蛋白H3（phospho-histone H3，PH3），雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）。CIS后35天免疫細胞化

4、學檢測β3-tubulin和突觸素（synaptophysin）；免疫印跡檢測突觸小體相關蛋白-25（synaptosomal-associated protein-25 kDa，SNAP-25）；以及小鼠行為學評分。
　　結(jié)果：免疫印跡和實時定量PCR結(jié)果顯示與假手術組相比，CIS后7、14、21和28天缺血側(cè)大腦半球IL-17A的基因與蛋白表達水平顯著升高，28天達峰值。缺血側(cè)SVZ和紋狀體區(qū)IL-17A陽性細胞數(shù)在CIS后7

5、、14、21和28天顯著增加。CIS后28天，抑制 IL-17A可顯著減少紋狀體 BrdU+/DCX+細胞數(shù)，而 rIL-17A可顯著增加紋狀體BrdU+/DCX+細胞數(shù)。然而抑制IL-17A或rIL-17A不影響CIS后28天SVZ區(qū)BrdU+、Ki67+或 PH3+細胞數(shù)。CIS后35天，抑制 IL-17A顯著減少缺血側(cè) SVZ區(qū) BrdU+、BrdU+/DCX+細胞數(shù)，顯著減少紋狀體BrdU+/DCX+細胞數(shù)，而rIL-17A則增

6、加缺血側(cè)SVZ區(qū)BrdU+、BrdU+/DCX+細胞數(shù)，顯著增加紋狀體BrdU+/DCX+細胞數(shù)。抑制IL-17A還可顯著減少缺血側(cè)紋狀體BrdU+/βIII-tubulin+細胞數(shù)，減少SNAP-25和synaptophysin的表達，顯著抑制CIS后神經(jīng)功能的恢復，rIL-17A可顯著增加BrdU+/βIII-tubulin+細胞數(shù)，增加SNAP-25和synaptophysin的表達，顯著促進CIS后神經(jīng)功能的恢復。結(jié)論：CIS恢

7、復期在SVZ和紋狀體區(qū)升高的IL-17A可顯著增加SVZ區(qū)神經(jīng)祖細胞壽命，促進神經(jīng)元分化和突觸再生，從而促進神經(jīng)功能恢復。
　　第二部分 p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/calpain1信號通路在CIS后IL-17A的促神經(jīng)再生中的作用
　　目的：探討白介素17A促進CIS后神經(jīng)再生的分子生物學機制。
　　方法：WT小鼠大腦中動脈栓塞，缺血60分鐘后再灌注。小鼠從CIS后14天開始，連續(xù)14天經(jīng)鼻腔給予重組白介素

8、17A蛋白（recombinant IL-17A，rIL-17A）或溶劑對照（vehicle），或者經(jīng)側(cè)腦室給予小鼠IL-17A中和抗體（anti-IL-17A mAb）或IgG1同型對照抗體。CIS后27天腹腔注射BrdU，間隔8個小時，16小時后灌注取材檢測祖細胞增殖活性。其中部分小鼠在鼻腔給予rIL-17A前30分鐘腹腔給予p38通路抑制劑SB203580或1％ DMSO，或者經(jīng)側(cè)腦室給予calpain1抑制劑PD151746或1

9、%DMSO。CIS后28天免疫印跡檢測 IL-17A，磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phospho-extracellular regulated protein kinase，p-ERK），磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phospho-c-Jun N-terminal kinase，p-JNK），磷酸化AKT（p-AKT），磷酸化p38(p-p38)，aII-spectrin，calpain1和calpain2的蛋白表達。CIS后35天免

10、疫細胞化學染色BrdU、DCX、β3-tubulin和突觸素（synaptophysin）；免疫印跡檢測SNAP25。
　　結(jié)果：IL-17A敲除，中和抗體中和IL-17A或rIL-17A干預均不影響CIS后28天缺血側(cè)腦組織p-ERK，p-JNK，p-AKT和calpain2的蛋白表達；抑制IL-17A顯著減少缺血側(cè)腦組織p-p38蛋白表達；而rIL-17A干預顯著增加p-p38蛋白表達。IL-17A敲除，中和抗體中和IL-17

11、A可顯著增加CIS后28天總calpain和calpain1的活性，而rIL-17A干預則顯著抑制總calpain和calpain1的活性。SB203580可顯著增加CIS后28天缺血側(cè)腦組織calpain1活性。提前加入SB203580則可阻斷IL-17A對總calpain和calpain1活性的抑制作用。然而 PD151746則對IL-17A和p-p38的蛋白表達無顯著影響。PD151746干預可顯著增加 CIS后35天缺血側(cè)紋狀體

12、 BrdU+/DCX+和BrdU+/β3-tubulin+細胞數(shù)，也顯著增加synaptophysin和SNAP25的表達。
　　結(jié)論：IL-17A通過p38 MAPK/calpain1信號通路促進CIS后神經(jīng)再生。
　　第三部分 IL-17A在CIS后的細胞來源以及分泌機制
　　目的：明確IL-17A在CIS恢復期的細胞來源，以及探討其細胞分泌機制。
　　方法：WT小鼠大腦中動脈栓塞，缺血60分鐘后再灌注。CI

13、S后28天免疫熒光雙染IL-17A和星形膠質(zhì)細胞標記GFAP，神經(jīng)元標記NeuN或小膠質(zhì)細胞標記Iba-1。CIS后14天缺血側(cè) SVZ區(qū)提取的原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，100 ng/ml脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）干預后免疫熒光和免疫印跡分別檢測細胞裂解液和培養(yǎng)上清液中IL-17A的蛋白表達；p38 MAPK特異性抑制劑SB203580或1%DMSO在LPS干預前30分鐘加入原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)液中。
　

14、　結(jié)果：在體實驗結(jié)果表明IL-17A與星形膠質(zhì)細胞標記GFAP共表達，而不與小膠質(zhì)細胞標記Iba-1或神經(jīng)元標記NeuN共表達。體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細胞實驗結(jié)果顯示，LPS可顯著增加細胞裂解液和培養(yǎng)上清液中 IL-17A的蛋白表達；而加入SB203580后，LPS對細胞裂解液和培養(yǎng)上清液中IL-17A的表達促進作用顯著被抑制。
　　結(jié)論：星形膠質(zhì)細胞是CIS恢復期IL-17A的主要細胞來源；星形膠質(zhì)細胞分泌IL-17A依賴于p3

15、8 MAPK信號通路。
　　第四部分 IL-17A對體外培養(yǎng)的SVZ區(qū)神經(jīng)祖/干細胞的增殖和分化的影響及其作用機制
　　目的：研究 IL-17A對體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)干/祖細胞（neural stem/progenitor cells，NSCs）的增殖分化的影響，并探討其作用機制。
　　方法：成年雄性IL-17A敲除（IL-17A knock-out，il-17a-/-）或野生型（wide-type，WT）小鼠大腦中動脈

16、栓塞，缺血60分鐘后再灌注。CIS后14天分離缺血側(cè)SVZ區(qū)NSCs培養(yǎng)。第二代神經(jīng)球接種后增殖，WT小鼠CIS后來源的第二代NSCs增殖液中連續(xù)7天給予0、10、50和100 ng/ml rIL-17A干預后24小時計數(shù)神經(jīng)球數(shù)量；收集細胞接種后分化，加入BrdU后16小時免疫熒光檢測BrdU陽性細胞的比例。來源于il-17a-/-小鼠的第二代NSCs分化后7天，以及rIL-17A（0、10、50和100 ng/ml）或活化的星形膠質(zhì)

17、細胞培養(yǎng)上清（加或不加 anti-IL-17A mAb）干預的 WT小鼠第二代 NSCs分化后7天，免疫熒光雙染β3-tubulin和GFAP。IL-17A中和抗體（anti-IL-17A mAb）或IgG1同型對照抗體與rIL-17A于分化開始后2小時同時加入分化液中。p38 MAPK特異性抑制劑SB203580在干預前30分鐘加入分化液中。第二代NSCs分化后2小時加入calpain1特異性抑制劑PD151746，連續(xù)給7天。免疫印

18、跡檢測p-p38，calpain1和calpain2的蛋白表達。
　　結(jié)果：IL-17A敲除后NSCs分化為β3-tubulin陽性神經(jīng)元顯著減少；10或50 ng/ml rIL-17A干預或者活化的星形膠質(zhì)細胞上清干預后NSCs分化為β3-tubulin陽性神經(jīng)元顯著增加，而分化為GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞顯著減少。Anti-IL-17A mAb顯著阻斷活化的星形膠質(zhì)細胞上清對NSCs神經(jīng)元分化的促進作用。給予 rIL-17A顯著

19、增加p-p38蛋白表達和calpain1活性。rIL-17A對p-p38蛋白表達的促進作用以及對calpain1活性的抑制作用可被 anti-IL-17A mAb顯著阻斷。預先給予 SB203580顯著阻斷rIL-17A對calpain1活性的抑制作用；而PD151746對p-p38蛋白表達無顯著影響。PD151746顯著增加NSCs分化為β3-tubulin+神經(jīng)元而減少GFAP+星形膠質(zhì)細胞。
　　結(jié)論：IL-17A通過p38