CathepsinB-Caspase信號(hào)通路參與腦缺血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡.pdf

1、目的:研究CathepsinB-Caspase信號(hào)通路在腦缺血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡中的作用及CathepsinB特異性抑制劑CA-074Me對(duì)其的影響。
　　 方法:采用大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(permanent middle cerebral arteryocclusion，pMCAO)方法，建立腦缺血的大鼠模型。大鼠腦缺血前10 min或缺血后6h側(cè)腦室注射CA-074Me，以腦梗塞體積、行為學(xué)癥狀及MAP2蛋白表達(dá)等指

2、標(biāo)評(píng)價(jià)CathepsinB特異性抑制劑CA-074Me對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用。應(yīng)用相對(duì)腦血流(relative cerebral blood flow，rCBF)檢測(cè)觀察CA-074Me對(duì)pMCAO大鼠局部腦血流的影響。Western Blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)皮層缺血區(qū)CathepsinB-Caspase通路相關(guān)蛋白的時(shí)程變化以及CA-074Me對(duì)蛋白表達(dá)的影響。采用原代培養(yǎng)的新生大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧缺糖(oxygen-glu

3、cosedeprivation，OGD)方法，建立腦缺血的細(xì)胞模型。LDH法檢測(cè)OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率。Western Blot方法檢測(cè)OGD誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中CathepsinB蛋白的時(shí)程變化以及CA-074Me對(duì)CathepsinB-Caspase通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:術(shù)前10min給予CA-074Me(0.65-5.2μg/μl)均可有效地減小pMCAO大鼠腦梗死體積(P＜0.0

4、1），其中0.65μg/μl和1.3μg/μl兩個(gè)劑量能有效的改善pMCAO大鼠的行為學(xué)癥狀(P＜0.05，P＜0.01)及大腦皮層缺血區(qū)MAP2蛋白的表達(dá);術(shù)后6小時(shí)給予1.3μg/μl CA-074Me，仍然能顯著減小pMCAO大鼠腦梗死體積(P＜0.01），有效改善pMCAO大鼠行為學(xué)癥狀(P＜0.05，P＜0.01)。0.65μg/μl和1.3μg/μl兩個(gè)劑量對(duì)pMCAO大鼠rCBF無(wú)明顯影響。Western Blot結(jié)果顯示

5、，皮層缺血區(qū)CathepsinB-Caspase通路相關(guān)蛋白CathepsinB在6h明顯激活(P＜0.01); Bid蛋白6h開(kāi)始激活（P＜0.05），24h達(dá)到高峰(P＜0.01); Caspase3蛋白3h表達(dá)開(kāi)始增加(P＜0.05），24小時(shí)達(dá)高峰(P＜0.01）。給予CA-074Me干預(yù)之后，CathepsinB、Bid、Caspase3蛋白激活顯著減少(P＜0.01)，線(xiàn)粒體Cyt-c向胞漿的轉(zhuǎn)移減少(P＜0.01），說(shuō)明C

6、A-074Me能有效的抑制皮層缺血區(qū)CathepsinB-Caspase通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證明了皮層缺血區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞CathepsinB和Caspase3分別在6h和12h激活，給予CA-074Me處理后兩者表達(dá)均下調(diào)。LDH結(jié)果顯示，CA-074Me(5，10，20μM)能劑量依賴(lài)性地降低星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD12h后LDH的漏出率(P＜0.05，P＜0.01)。Western Blot結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的星形膠

7、質(zhì)細(xì)胞OGD6h后CathepsinB蛋白明顯激活(P＜0.01);給予CA-074Me干預(yù)之后，active-CathepsinB、tBid、active-Caspase3蛋白下調(diào)(P＜0.01），線(xiàn)粒體Cyt-c向胞漿轉(zhuǎn)移減少(P＜0.01），說(shuō)明CA-074Me能有效的抑制OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞CathepsinB-Caspase通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論:1.CathepsinB特異性抑制劑CA-074Me對(duì)pM