補(bǔ)氣活血、清熱泄?jié)嶂兴巻误w對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、目的：
　　觀察毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的干預(yù)作用，探討三種中藥單體通過調(diào)控Rho/ROCK通路、AKT通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架及通透性的影響，為其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)支持，同時(shí)為中醫(yī)采用補(bǔ)氣活血清熱泄?jié)岱ㄖ委焹?nèi)皮損傷相關(guān)性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　首先以0.2μg/ml LPS作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vei

2、n endothelial cells，HUVECs)24h，造成血管內(nèi)皮損傷模型。Y27632（ROCK特異性抑制劑）和纈沙坦（西藥對(duì)照，AngⅡ受體1拮抗劑，Rho/ROCK信號(hào)通路的間接抑制劑）作為陽性對(duì)照藥物。我們分別依次觀察了毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷后的HUVECs的變化:MTT法觀察細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI染色觀察凋亡率，transwell觀察細(xì)胞遷移能力，10 mg

3、/mL波連蛋白預(yù)包被/無包被96孔板觀察細(xì)胞黏附能力，硝酸還原酶法觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清中的cNOS、iNOS和NO濃度，免疫熒光觀察細(xì)胞骨架和黏著斑蛋白的結(jié)構(gòu)和分布。研究中，三種中藥單體都表現(xiàn)出卓越的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)能力。
　　然后我們?cè)噲D對(duì)三種中藥單體的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討。首先，以內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能PCR基因芯片技術(shù)篩選可能的基因譜，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架重構(gòu)相關(guān)基因，如Rho/ROCK、AKT和FAK-PI3K信號(hào)通路相關(guān)基因在其中起重要

4、作用，尤以Rho/ROCK通路為主。結(jié)合基因芯片結(jié)果和文獻(xiàn)中各基因功能，擬定觀察Rho/ROCK通路中的關(guān)鍵基因如纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，整合素A5(integrin A5，ITGA5)，Ras同源基因家族成員(Ras homolog genefamily member A，RhoA)，肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸肌醇3-激酶(

5、phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate3-kinase，PI3K)，黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR2)的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，

6、同時(shí)以Western blotting對(duì)ITGA5，RhoA，4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，PIP2)和磷酸化的肌球蛋白輕鏈(Phosphorylated myosin light chain，PMLC)進(jìn)行蛋白水平的研究。
　　結(jié)果：
　　(1)LPS成功誘導(dǎo)構(gòu)建了HUVECs細(xì)胞骨架損傷模型。HUVECs細(xì)胞增殖減弱、凋亡增加，細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白皺縮、黏

7、著斑蛋白聚集，LPS活化內(nèi)皮、誘導(dǎo)肌球蛋白收縮，導(dǎo)致細(xì)胞間隙開放、內(nèi)皮通透性增加、細(xì)胞遷移能力和黏附能力下降。LPS作用24h后，cNOS減低，tNOS、iNOS、NO升高，呈現(xiàn)內(nèi)皮損傷和炎癥狀態(tài)。同時(shí)，LPS激活Rho/ROCK信號(hào)通路，提高Rho/ROCK通路相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)(FN，ITG A5，RhoA，MLCP，PI3K FAK，VEGF，VEGFR2)。Y27632和纈沙坦特異性阻斷了Rho/ROCK通路，顯現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞骨架

8、損傷的較強(qiáng)的保護(hù)作用。
　　(2)毛蕊異黃酮誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞遷移能力、降低黏附能力、cNOS升高、iNOS減低、細(xì)胞骨架和黏著斑蛋白形態(tài)和分布狀況改善，即減少細(xì)胞數(shù)量、提高細(xì)胞質(zhì)量。毛蕊異黃酮的內(nèi)皮保護(hù)作用涉及多條信號(hào)通路。毛蕊異黃酮通過增加NO的生成促進(jìn)MLCP的激活，MLCP活化后降低PMLC，直接對(duì)抗Rho/ROCK通路的活化，同時(shí)通過降低VEGF、VEGF.R2和PI3K阻斷AKT信號(hào)通路，發(fā)揮其內(nèi)皮保護(hù)

9、作用。
　　(3)丹參酮ⅡA抑制HUVECs細(xì)胞凋亡、改善了細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白和黏著斑蛋白的形態(tài)和分布狀況、提高細(xì)胞遷移和黏附能力，提高cNOS濃度。丹參酮ⅡA是內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)保護(hù)劑，其機(jī)制主要是通過下調(diào)ITG A5的表達(dá)而阻斷Rho/ROCK通路的激活。
　　(4)大黃素誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞遷移能力和黏附能力、cNOS升高、iNOS減低，但對(duì)細(xì)胞骨架和黏著斑蛋白基本沒有改善作用。大黃素的內(nèi)皮保護(hù)作用復(fù)雜，涉及多條信

10、號(hào)通路，通過輕度抑制Rho/ROCK通路、調(diào)節(jié)AKT和/或FAK-PI3K信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　(1)LPS誘導(dǎo)了HUVECs細(xì)胞骨架損傷，毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素通過穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)凋亡率、調(diào)節(jié)細(xì)胞合成和利用NO的能力、改變細(xì)胞遷移和黏附能力，而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性、改善內(nèi)皮屏障功能。
　　(2)丹參酮ⅡA抑制HUVECs凋亡，毛蕊異黃酮和大黃素促進(jìn)HUVECs凋亡，維持調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)

11、量的穩(wěn)定。
　　(3)三種中藥單體對(duì)細(xì)胞骨架的保護(hù)機(jī)制分別涉及多個(gè)信號(hào)通路和信號(hào)通路間的串話，以Rho/ROCK信號(hào)通路為最主要的調(diào)節(jié)通路，還涉及AKT和/或FAK-PI3K通路，及其彼此間的串話。毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、大黃素均參與了Rho/ROCK通路的調(diào)節(jié)，其中，毛蕊異黃酮同時(shí)還通過降低VEGF、VEGF.R2和PI3K阻斷AKT信號(hào)通路，發(fā)揮作用;丹參酮ⅡA以下調(diào)ITGA5的表達(dá)而阻斷Rho/ROCK通路的激活為主，同時(shí)也

12、經(jīng)PI3K和NO與其他通路互相協(xié)調(diào);大黃素的調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜，通過輕度抑制Rho/ROCK通路、調(diào)節(jié)AKT和/或FAK-PI3K信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
　　(4)雖然機(jī)制和過程不同，但三個(gè)中藥單體均顯示了對(duì)細(xì)胞骨架損傷后修復(fù)的調(diào)節(jié)功效和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　研究意義：
　　本研究首次將中藥單體的內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制與基因芯片技術(shù)聯(lián)系起來，從對(duì)細(xì)胞骨架損傷后修復(fù)、內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)和機(jī)制的角度進(jìn)行了研究。從