花生根特異啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、栽培花生（ArachishypogaeaL.）是我國重要的油料作物和經(jīng)濟作物，但由于地下害蟲蠐螬的危害，花生的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重影響。實驗室前期獲得了一系列對蠐螬有殺蟲活性的cry8類基因，如能獲得花生根部特異啟動子，驅(qū)動外源殺蟲基因在花生根部的高效表達將為蠐螬的綠色防控提供新的手段。本研究根據(jù)前期實驗室構(gòu)建的基因數(shù)字表達譜，篩選、克隆花生根特異表達啟動子，以期獲得在整個花生生長季都高效表達的啟動子，為培育抗蟲花生新種質(zhì)提供重要的順式作

2、用元件。主要研究結(jié)果如下：
　　1．克隆了一個花生5'-甲硫腺苷/S-腺苷半胱氨酸核苷酶（5'-methylthioadenosine/S-adenosylho-mocysteine nucleosidase）基因上游1486 bp的啟動子序列，將其初步命名為AhMtan啟動子。對該啟動子序列進行生物信息學分析表明，該區(qū)段含有12個 ROOTMOTIFTAPOX1元件，2個OSE2ROOTNODULE元件，二者都是與根特異表達相關(guān)

3、的順式作用元件。根據(jù)根特異表達順式作用元件的分布情況，構(gòu)建了3個5'端系列缺失的植物表達載體，轉(zhuǎn)化煙草后，將獲得的卡那抗性苗進行GUS染色，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pAhMtan1247、pAhMtan523、pAhMtan235載體的煙草根部均被染成藍色，而葉片無藍色斑點，證明AhMtan啟動子為根特異啟動子，其最小核心區(qū)235 bp的啟動子片段仍能指導報告基因在根部的特異表達。
　　2．克隆了一個花生赤霉素氧化酶（Gibberellin2

4、0 oxidase）基因上游2111 bp的啟動子序列，將初步命名為AhGAox啟動子。含有15個ROOTMOTIFTAPOX1元件，1個與OSE1ROOTNODULE元件，2個 OSE2ROOTNODULE元件，三者都是與根特異表達相關(guān)的順式作用元件；構(gòu)建了3個5'端系列缺失的植物表達載體，并轉(zhuǎn)化煙草，對抗性苗進行GUS染色，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pAhGAox1805、pAhGAox518載體的煙草根部均被染成藍色，而葉片無藍色斑點，證明Ah

5、GAox啟動子為根特異表達載體啟動子，其最小核心區(qū)518 bp的啟動子片段仍能指導報告基因在根部的特異表達。
　　3．克隆了一個花生NBS-LRR型抗逆性（NBS-LRR type disease resistance）基因上游1966bp的調(diào)控序列，將初步命名為 AhNDrp啟動子。該區(qū)段含有10個 ROOTMOTIFTAPOX1元件，2個OSE1ROOTNODULE元件和2個OSE2ROOTNODULE元件，根據(jù)基因的上游序列

6、，構(gòu)建了2個5'端系列缺失啟動子的植物表達載體，并轉(zhuǎn)化煙草進行GUS染色分析，轉(zhuǎn)pAhNDrp1360載體的煙草根部被染成藍色，而葉片無藍色斑點，證明AhNDrp啟動子為根特異啟動子。
　　4．將含有天然抗性相關(guān)的巨噬細胞蛋白基因啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化煙草后，進行GUS組織化學分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)1021 bp啟動子和920 bp啟動子載體的煙草，根部被染成藍色，而葉片無藍色斑點，而轉(zhuǎn)646 bp啟動子載體的煙草，根部和葉脈處被染為藍色。證