楊樹維管組織特異啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、木材是自然界非常重要的可再生生物質(zhì)，是地球上物質(zhì)能量循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。通過分子育種進(jìn)行木材材性的改良，需深入了解木材形成過程的關(guān)鍵基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。啟動子在基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，它在很大程度上決定所控基因的表達(dá)強(qiáng)度及時(shí)空模式。植物基因工程中常用的組成型啟動子表達(dá)具有持續(xù)性，不受外界因素的誘導(dǎo)，在實(shí)踐中取得了廣泛的應(yīng)用，但導(dǎo)入的基因在不同的發(fā)育階段和組織表達(dá)無明顯差異且強(qiáng)度大，可能會影響植物正常的生長發(fā)育。因此需要尋找一些更有效的誘導(dǎo)型

2、或特異性啟動子代替，以期更好地調(diào)控基因的表達(dá)。
　　前期實(shí)驗(yàn)中利用毛白楊（Populus tomentosa Carr）維管再生實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，通過基因芯片分析已經(jīng)獲知大量在毛白楊次生維管再生過程中特異表達(dá)的基因，選取了差異表達(dá)基因NST3，通過生物信息學(xué)的方法，找到同源性較高的基因NAC068。
　　通過PCR同源克隆的方法，從毛白楊中獲得了NCAC068基因5＇側(cè)翼區(qū)901bp的片段（pProNAC068），與已發(fā)表的毛果楊序

3、列比較發(fā)現(xiàn)，兩者同源性達(dá)到94.67％。在PlantCARE數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行順式作用調(diào)控因子搜索，結(jié)果表明該序列具有多個(gè)核心啟動子元件TATA-box和上游啟動子元件CAAT-box的同源序列區(qū)，還含有多個(gè)順式作用因子等調(diào)控元件。
　　將該片段置換pBI121載體中的35S啟動子，即與報(bào)告基因GUS融合，構(gòu)建了植物表達(dá)載體 pProNAC068::GUS，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化銀腺楊（Populus alba×P. glandul

4、osa）無性系84K，經(jīng)PCR檢測，獲得了5株轉(zhuǎn)基因陽性植株。經(jīng)過GUS活性檢測分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子主要在維管形成層區(qū)域表達(dá)。以轉(zhuǎn)基因植株莖段為材料，提取其總RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，從整個(gè)莖段的整體角度來分析，其轉(zhuǎn)錄水平大概是35S的1/3倍，而pProNAC068所驅(qū)動的GUS基因表達(dá)的區(qū)域占據(jù)整個(gè)莖段的1/5，從而推測該啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度與35S相當(dāng)或者更高。
　　該啟動子的分離，為下一步構(gòu)建維管組織特異表達(dá)載體，