基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的右蘭索拉唑生物等效性評(píng)價(jià)和QO-58lysine在大鼠體內(nèi)代謝、排泄研究.pdf

1、右蘭索拉唑?qū)儆谫|(zhì)子泵抑制劑，是由日本武田公司研發(fā)的治療食管炎的新藥，本藥在劑型上采用雙延遲釋放（DDR）系統(tǒng)，延長(zhǎng)了藥物的作用時(shí)間，增強(qiáng)了患者的依從性，臨床療效明顯，因?qū)＠Ｗo(hù)于2020年即將到期，因此該藥成為仿制熱點(diǎn)。
　　QO-58是經(jīng)過(guò)高通量篩選得到的一種全新KCNQ型鉀離子通道開(kāi)放劑，藥效學(xué)初步研究提示其具有抗驚厥、抗癲癇以及鎮(zhèn)痛等作用，其賴氨酸鹽（QO-58 lysine）改善了吸收，提高了療效，在完成了前期藥理、毒理及

2、部分藥代、毒代研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)展本次體內(nèi)代謝、排泄研究，為新藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　LC-MS/MS技術(shù)是將液相色譜分離與質(zhì)譜檢測(cè)手段相結(jié)合的技術(shù)，具有分離能力強(qiáng)、監(jiān)測(cè)靈敏度高和專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，成為新藥研發(fā)和體內(nèi)外藥物分析的重要手段。本課題運(yùn)用此技術(shù)研究了國(guó)內(nèi)高仿的武田Dexilant產(chǎn)品（右蘭索拉唑緩釋膠囊）在Beagle犬體內(nèi)的生物等效性，為一致性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)參考；同時(shí)還研究了QO-58 lysine在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)

3、，分析了QO-58 lysine在大鼠體內(nèi)的多種代謝產(chǎn)物，該研究結(jié)果為進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用QO-58 lysine提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：右蘭索拉唑緩釋膠囊在Beagle犬體內(nèi)的生物等效性評(píng)價(jià)
　　目的：
　　研究右蘭索拉唑的受試藥物和參比藥物（Dexilant）在Beagle犬體內(nèi)是否具有生物等效特征。
　　方法：
　　1.樣品收集：本實(shí)驗(yàn)采用雙周期隨機(jī)交叉設(shè)計(jì)，每一個(gè)周期，飼喂30mg右蘭索拉

4、唑緩釋膠囊。從Beagle犬腿部靜脈處采集血液至真空肝素管，分別收集給藥前和給藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h時(shí)間點(diǎn)的血液樣本。
　　2.樣品預(yù)處理：采用液液萃取法（乙酸乙酯）進(jìn)行處理。
　　3.檢測(cè)條件：采用Phenomenex C18分析柱，流動(dòng)相為甲醇（A）：2 mM乙酸銨水溶液（B），采用梯度洗脫程序。檢測(cè)方式為正離子、多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）

5、，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z369.8→252.0（右蘭索拉唑），m/z345.9→198.0（內(nèi)標(biāo)，IS，奧美拉唑）。
　　4.生物等效性：計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì) AUC0-t、AUC0-∞、Cmax經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，判斷兩種制劑是否生物等效。
　　結(jié)果：
　　1.右蘭索拉唑在Beagle犬血漿中的線性關(guān)系良好（r≥0.9960），日內(nèi)精密度和日間精密度符合要求，無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)，穩(wěn)定

6、性良好。
　　2.單劑量給予試驗(yàn)藥物和參比藥物，血漿中右蘭索拉唑的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（AUC0-t、AUC0-∞和Cmax）經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行雙單側(cè) t檢驗(yàn)，其結(jié)果說(shuō)明兩種制劑間沒(méi)有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)建立的LC-MS/MS方法，具有簡(jiǎn)單可靠等特點(diǎn)，能夠滿足生物樣品的分析要求。兩種右蘭索拉唑緩釋膠囊在 Beagle犬體內(nèi)具有相似的體內(nèi)過(guò)程以及藥代動(dòng)力學(xué)特征，兩者具有生物等效性。
　　第二部分：液質(zhì)聯(lián)

7、用法測(cè)定大鼠尿液、糞便和膽汁中QO-58 lysine的含量及排泄動(dòng)力學(xué)研究
　　目的：
　　建立QO-58 lysine在大鼠尿液、糞便和膽汁中的液質(zhì)聯(lián)用方法（LC-MS/MS），并對(duì)其進(jìn)行排泄動(dòng)力學(xué)研究。
　　方法：
　　1.樣品收集：以50 mg/kg的劑量灌胃給予QO-58 lysine后，采用代謝籠收集其0~4、4~8、8~12、12~24、24~36、36~48、48~60以及60~72 h的尿液與糞

8、便樣品。麻醉后對(duì)大鼠進(jìn)行膽管插管，縫合后在清醒狀態(tài)下收集0~4、4~8、8~12、12~16、16~20、20~24、24~28、28~32、32~36、36~40、40~48、48~52、52~56、56~60、60~64、64~68和68~72 h的膽汁樣品。
　　2.樣品的預(yù)處理：尿液和膽汁采用液液萃取法；糞便采用乙腈沉淀法。
　　3.檢測(cè)條件：采用Phenomenex C18分析柱，乙腈（A）和2 mmol/L

9、>　　乙酸銨和0.2％(v/v)甲酸的水溶液（B）為流動(dòng)相，流速為0.5 ml/min。采用電噴霧離子源、正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)物（IS）為尼莫地平。被測(cè)成分的離子對(duì)分別為QO-58 lysine m/z443.1→361.1，尼莫地平m/z419.2→343.2。
　　結(jié)果：
　　1.QO-58 lysine在尿液、糞便和膽汁中的線性關(guān)系良好（r≥0.9943），日內(nèi)精密度和日間精密度均符合要求，基質(zhì)效應(yīng)69

10、.48%~99.57%，穩(wěn)定性良好；
　　2.72 h尿液的累計(jì)排泄率為(0.0245±0.0324)%，糞便的累計(jì)排泄率為(92.94±4.71)%，膽汁的累計(jì)排泄率為(2.05±0.68)%。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用 LC-MS/MS方法對(duì)大鼠的尿液、糞便和膽汁中 QO-58 lysine的含量進(jìn)行測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便快捷、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高。經(jīng)方法學(xué)研究表明，LC-MS/MS方法能夠滿足樣品測(cè)定的要

11、求。
　　2.QO-58 lysine在灌胃給藥后主要經(jīng)過(guò)糞便排泄，一部分經(jīng)過(guò)膽汁排泄，極少量通過(guò)尿液排泄。另外，約有7%的藥物有待探明去向，可能是在肝臟等器官中產(chǎn)生了一些新的代謝產(chǎn)物。
　　第三部分 QO-58 lysine在大鼠體內(nèi)的代謝研究
　　目的：
　　建立LC-MS/MS和HPLC-QTOF-MS的方法，分離篩選并且分析推測(cè)QO-58 lysine在大鼠尿液和膽汁中的代謝產(chǎn)物。
　　方法：

12、>　　1.采用Phenomenex C18分析柱，流動(dòng)相為乙腈（A）和2 mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸的水溶液（B），梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧離子源。
　　2.大鼠灌胃給予QO-58 lysine50 mg/kg，分別收集尿液和膽汁。采用液液萃取法對(duì)尿液和膽汁樣品進(jìn)行濃縮和處理。采用高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-QTOF-MS）技術(shù)分析樣品，正/負(fù)離子模式，全掃描采集。
　　3.數(shù)據(jù)采集完畢后，先使用“M

13、etabolitepilot1.5”中的“碎片和中性丟失虧損過(guò)濾（Fragment and Neutral loss defect filter）”功能對(duì)其中的代謝物進(jìn)行初步的篩選；之后再使用“Peakview2.2”中的“Masterview”功能，針對(duì)之前初步篩選的結(jié)果進(jìn)行更進(jìn)一步的分析，對(duì)比有關(guān)化合物的精確分子量、分子式、二級(jí)質(zhì)譜圖、保留時(shí)間及質(zhì)譜信息，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)。最后根據(jù)代謝物結(jié)構(gòu)推測(cè)其代謝途徑。
　　結(jié)果：

14、　　根據(jù)生物體內(nèi)藥物的代謝轉(zhuǎn)化的規(guī)律以及母體藥物總結(jié)的裂解規(guī)律，在大鼠體內(nèi)檢測(cè)出11種代謝產(chǎn)物，其中I相代謝產(chǎn)物8種，II相代謝產(chǎn)物3種。并對(duì)各個(gè)代謝產(chǎn)物的代謝途徑進(jìn)行了解析。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)總共檢測(cè)到11種代謝產(chǎn)物。QO-58 lysine所檢測(cè)到的I相代謝產(chǎn)物可以發(fā)生鹵素原子的消除反應(yīng)、羥基化和雙羥基化反應(yīng)；II相代謝物可以發(fā)生硫酸化、葡萄糖醛酸化反應(yīng)以及與 N-乙酰半胱氨酸的結(jié)合反應(yīng)。
　　2.建立了