缺氧誘導(dǎo)因子-1α在創(chuàng)傷性顱腦損傷后血管再生過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后血管損傷是TBI關(guān)鍵的原發(fā)事件，可引起一系列繼發(fā)損傷，是TBI修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。成功的血管再生為神經(jīng)元再生和重塑提供關(guān)鍵的神經(jīng)血管微環(huán)境，此過(guò)程中其產(chǎn)生的有效灌注可以清除損傷因子，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)運(yùn)，為神經(jīng)元和突觸的再生提供營(yíng)養(yǎng)，有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此，近年來(lái)TBI治療的促血管生成策略越來(lái)越受到人們的關(guān)注。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducib

2、le factor-1α, HIF-1α)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)及一氧化氮合酶(iNOS)等靶基因的轉(zhuǎn)錄，是低氧條件時(shí)血管系統(tǒng)應(yīng)答的調(diào)節(jié)中心。相關(guān)研究證實(shí)，HIF-1α在大鼠缺血性心肌損傷和腦損傷模型中可以誘導(dǎo)新生血管的形成，然而HIF-1α在TBI后的表達(dá)情況及其在血管再生中的作用機(jī)制尚不明確，本研究旨在探討HIF-1α在大鼠TBI模型中的表達(dá)情況及血管再生過(guò)程中的作用和機(jī)

3、制。
　　第一部分大鼠顱腦損傷后缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)規(guī)律及其表達(dá)機(jī)制
　　目的:觀察大鼠顱腦損傷后缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，并探討其可能的表達(dá)機(jī)制。
　　方法:將56只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=8只)、假手術(shù)組(n=8只)、創(chuàng)傷性顱腦損傷組(TBI組，n=40只)，通過(guò)改良Feeney法建立顱腦損傷(TBI)模型，TBI組按從受傷

4、到處死時(shí)間的長(zhǎng)短分為T(mén)BI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d和TBI-14d共5個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠，用正常大鼠作為Sham組，假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚及打開(kāi)骨窗，保證硬膜完整，不進(jìn)行打擊損傷。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription–polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)模型建立后 HIF-1α mRNA、蛋白質(zhì)及上游調(diào)控因子

5、脯氨酸羥化酶區(qū)域蛋白2(Prolyl Hydroxylase Domain Protein2,PHD2)的表達(dá)情況；采用HE染色觀察TBI模型建立后病灶的病理變化，采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測(cè)挫傷灶及周?chē)X組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。
　　結(jié)果:(1)RT-PCR對(duì)照組、假手術(shù)組以及TBI組SD大鼠腦組織中均檢測(cè)到HIF-1αmRNA的表達(dá)，三組表達(dá)無(wú)明顯差異(p＞0.05)；與對(duì)

6、照組相比，TBI-24h、3dHIF-1αmRNA表達(dá)明顯增高(P<0.01)，TBI-6h、7d、14d無(wú)明顯差異(p＞0.05)；(2)Western blot對(duì)照組、假手術(shù)組未檢測(cè)到HIF-1α蛋白的表達(dá)。PHD2蛋白于sham組及假手術(shù)組正常表達(dá)，于TBI組中明顯降解，三組表達(dá)差異明顯(P<0.05)；(3)免疫組化對(duì)照組、假手術(shù)組未檢測(cè)到HIF-1α蛋白表達(dá)，顱腦損傷后挫傷灶及周?chē)X組織HIF-1α表達(dá)增加，陽(yáng)性表達(dá)主要位于神

7、經(jīng)元細(xì)胞胞核內(nèi)；TBI組各亞組于TBI-6h開(kāi)始表達(dá)，于TBI-3d到達(dá)表達(dá)高峰，TBI-7d開(kāi)始下降，至TBI-14d恢復(fù)至損傷前水平；
　　結(jié)論:顱腦損傷后各種病理過(guò)程導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)增加，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，PHD2蛋白的降解使HIF-1α的表達(dá)增加。
　　第二部分2-ME-2對(duì)大鼠顱腦損傷缺氧誘導(dǎo)因子-1α及其下游血管再生相關(guān)因子表達(dá)的影響
　　目的:通過(guò)檢測(cè)予以二甲基雌氧

8、二醇(2-methoxyestradiol，2-ME-2)干預(yù)后大鼠損傷灶及周?chē)X組織中HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9和CD31表達(dá)的變化，探討HIF-1α在TBI后大鼠血管新生中可能起到的作用。
　　方法:成年健康SD大鼠80只，隨機(jī)分為T(mén)BI組和TBI+2-ME-2組，每組40只，兩組均參照改良Feeney自由落體法制作大鼠顱腦損傷模型。根據(jù)傷后處死時(shí)間分別將兩組隨機(jī)分6h、24h、3d、7d和14d共5個(gè)亞組

9、，每亞組各8只。TBI+2-ME-2-6h、24h亞組于模型制作成功后即刻腹腔注射2-ME-2(2.5mg/kg)一次，3d、7d和14d亞組于傷后注射一次，連續(xù)于傷后2天各注射一次，TBI組于同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量DMSO。每亞組隨機(jī)取四只大鼠處死后取挫傷灶及周?chē)X組織通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)HIF-1α在兩組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況；通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9的表達(dá)情況；剩余的4只

10、大鼠采用HE染色觀察傷后病灶的病理變化，采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測(cè)挫傷灶及周?chē)X組織中CD31蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。
　　結(jié)果:(1)Western blot大鼠TBI模型制作成功后6h HIF-1α蛋白表達(dá)開(kāi)始增加，24h到3d內(nèi)達(dá)到高峰，14d恢復(fù)至損傷前水平；使用HIF-1α阻滯劑2-ME-2干預(yù)后HIF-1α在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)較損傷組均明顯下降(p＜0.01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；(2

11、)RT-PCR①損傷組和抑制劑組HIF-1αmRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變(p>0.05)；②VEGF在損傷組6h表達(dá)增加，7d和14d高表達(dá),使用2-ME-2干預(yù)后VEGF mRNA水平較損傷組明顯降低(p＜0.05，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；③Ang-1 mRNA的表達(dá)水平：損傷組Ang-1 mRNA在TBI后早期表達(dá)不明顯，7d、14d表達(dá)明顯增加，說(shuō)明Ang-1參與新生血管的成熟調(diào)控，使用2-ME-2干預(yù)后Ang-1 mRNA水平較損傷

12、組表達(dá)明顯降低(p＜0.01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；④TBI組MMP-9 mRNA的表達(dá)水平：MMP-9在損傷組6h表達(dá)增加，24h達(dá)高峰，并處于高峰狀態(tài)達(dá)3d，7d表達(dá)開(kāi)始下降，14d表達(dá)較前明顯降低，2-ME-2干預(yù)后MMP-9mRNA水平在TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d上表達(dá)較損傷組明顯降低(**p＜0.01、*p＜0.05，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；(3)免疫組化TBI組SD大鼠腦組織CD31的表達(dá)，在TBI-