缺氧誘導因子-1α在創(chuàng)傷性顱腦損傷后血管再生過程中的作用及機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后血管損傷是TBI關鍵的原發(fā)事件，可引起一系列繼發(fā)損傷，是TBI修復的關鍵環(huán)節(jié)。成功的血管再生為神經元再生和重塑提供關鍵的神經血管微環(huán)境，此過程中其產生的有效灌注可以清除損傷因子，促進神經修復和生長因子的轉運，為神經元和突觸的再生提供營養(yǎng)，有利于神經功能的恢復。因此，近年來TBI治療的促血管生成策略越來越受到人們的關注。缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducib

2、le factor-1α, HIF-1α)是一種轉錄調節(jié)因子，可調控血管內皮細胞生長因子(VEGF)、促紅細胞生成素(EPO)及一氧化氮合酶(iNOS)等靶基因的轉錄，是低氧條件時血管系統(tǒng)應答的調節(jié)中心。相關研究證實，HIF-1α在大鼠缺血性心肌損傷和腦損傷模型中可以誘導新生血管的形成，然而HIF-1α在TBI后的表達情況及其在血管再生中的作用機制尚不明確，本研究旨在探討HIF-1α在大鼠TBI模型中的表達情況及血管再生過程中的作用和機

3、制。
　　第一部分大鼠顱腦損傷后缺氧誘導因子-1α的表達規(guī)律及其表達機制
　　目的:觀察大鼠顱腦損傷后缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的動態(tài)表達規(guī)律，并探討其可能的表達機制。
　　方法:將56只雄性SD大鼠隨機分為對照組(n=8只)、假手術組(n=8只)、創(chuàng)傷性顱腦損傷組(TBI組，n=40只)，通過改良Feeney法建立顱腦損傷(TBI)模型，TBI組按從受傷

4、到處死時間的長短分為TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d和TBI-14d共5個亞組，每個亞組8只大鼠，用正常大鼠作為Sham組，假手術組僅切開皮膚及打開骨窗，保證硬膜完整，不進行打擊損傷。利用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription–polymerase chain reaction，RT-PCR)技術及Western blot技術檢測模型建立后 HIF-1α mRNA、蛋白質及上游調控因子

5、脯氨酸羥化酶區(qū)域蛋白2(Prolyl Hydroxylase Domain Protein2,PHD2)的表達情況；采用HE染色觀察TBI模型建立后病灶的病理變化，采用免疫組織化學方法(SP法)檢測挫傷灶及周圍腦組織中HIF-1α蛋白的表達情況，應用顯微圖像分析系統(tǒng)計算陽性細胞數目。
　　結果:(1)RT-PCR對照組、假手術組以及TBI組SD大鼠腦組織中均檢測到HIF-1αmRNA的表達，三組表達無明顯差異(p＞0.05)；與對

6、照組相比，TBI-24h、3dHIF-1αmRNA表達明顯增高(P<0.01)，TBI-6h、7d、14d無明顯差異(p＞0.05)；(2)Western blot對照組、假手術組未檢測到HIF-1α蛋白的表達。PHD2蛋白于sham組及假手術組正常表達，于TBI組中明顯降解，三組表達差異明顯(P<0.05)；(3)免疫組化對照組、假手術組未檢測到HIF-1α蛋白表達，顱腦損傷后挫傷灶及周圍腦組織HIF-1α表達增加，陽性表達主要位于神

7、經元細胞胞核內；TBI組各亞組于TBI-6h開始表達，于TBI-3d到達表達高峰，TBI-7d開始下降，至TBI-14d恢復至損傷前水平；
　　結論:顱腦損傷后各種病理過程導致腦組織缺血缺氧，誘導缺氧誘導因子-1α表達增加，其表達調控機制為轉錄后調控，PHD2蛋白的降解使HIF-1α的表達增加。
　　第二部分2-ME-2對大鼠顱腦損傷缺氧誘導因子-1α及其下游血管再生相關因子表達的影響
　　目的:通過檢測予以二甲基雌氧

8、二醇(2-methoxyestradiol，2-ME-2)干預后大鼠損傷灶及周圍腦組織中HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9和CD31表達的變化，探討HIF-1α在TBI后大鼠血管新生中可能起到的作用。
　　方法:成年健康SD大鼠80只，隨機分為TBI組和TBI+2-ME-2組，每組40只，兩組均參照改良Feeney自由落體法制作大鼠顱腦損傷模型。根據傷后處死時間分別將兩組隨機分6h、24h、3d、7d和14d共5個亞組

9、，每亞組各8只。TBI+2-ME-2-6h、24h亞組于模型制作成功后即刻腹腔注射2-ME-2(2.5mg/kg)一次，3d、7d和14d亞組于傷后注射一次，連續(xù)于傷后2天各注射一次，TBI組于同一時間點腹腔注射等量DMSO。每亞組隨機取四只大鼠處死后取挫傷灶及周圍腦組織通過Western blot技術檢測HIF-1α在兩組不同時間點的表達情況；通過RT-PCR技術檢測HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9的表達情況；剩余的4只

10、大鼠采用HE染色觀察傷后病灶的病理變化，采用免疫組織化學方法(SP法)檢測挫傷灶及周圍腦組織中CD31蛋白的表達情況，應用顯微圖像分析系統(tǒng)計陽性細胞的數目。
　　結果:(1)Western blot大鼠TBI模型制作成功后6h HIF-1α蛋白表達開始增加，24h到3d內達到高峰，14d恢復至損傷前水平；使用HIF-1α阻滯劑2-ME-2干預后HIF-1α在各個時間點的表達較損傷組均明顯下降(p＜0.01，有顯著統(tǒng)計學意義)；(2

11、)RT-PCR①損傷組和抑制劑組HIF-1αmRNA表達水平沒有明顯改變(p>0.05)；②VEGF在損傷組6h表達增加，7d和14d高表達,使用2-ME-2干預后VEGF mRNA水平較損傷組明顯降低(p＜0.05，有顯著統(tǒng)計學意義)；③Ang-1 mRNA的表達水平：損傷組Ang-1 mRNA在TBI后早期表達不明顯，7d、14d表達明顯增加，說明Ang-1參與新生血管的成熟調控，使用2-ME-2干預后Ang-1 mRNA水平較損傷

12、組表達明顯降低(p＜0.01，有顯著統(tǒng)計學意義)；④TBI組MMP-9 mRNA的表達水平：MMP-9在損傷組6h表達增加，24h達高峰，并處于高峰狀態(tài)達3d，7d表達開始下降，14d表達較前明顯降低，2-ME-2干預后MMP-9mRNA水平在TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d上表達較損傷組明顯降低(**p＜0.01、*p＜0.05，有顯著統(tǒng)計學意義)；(3)免疫組化TBI組SD大鼠腦組織CD31的表達，在TBI-