SIRT1在創(chuàng)傷性腦損傷后的功能及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病,具有極高的致死率及致殘率,已經(jīng)引起國際衛(wèi)生組織的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),引起創(chuàng)傷性腦損傷的主要機制包括谷氨酸興奮性毒性、DNA損傷、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生以及促凋亡因子的調(diào)節(jié)等等。目前臨床上對于TBI治療有效的神經(jīng)保護性藥物很少,主要原因是對TBI后分子代謝及調(diào)控的機制還不十分透徹,常常影響傷者的治療及預(yù)后。因此,積極探索

2、可以激活內(nèi)源性的存活信號及修復(fù)機制的關(guān)鍵分子,成為TBI治療的重要策略。
　　研究發(fā)現(xiàn),NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)-依賴的去乙?；?Sir2(silence information regulator two)與酵母的長壽有關(guān)。SIRT1是哺乳動物中和酵母Sir2最接近的亞型,其在腦組織中的表達明顯高于其他器官。通過藥理學(xué)或基因調(diào)控的方法調(diào)節(jié)SIRT1的活性及表達在許多神經(jīng)代謝性

3、疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。然而,一些研究發(fā)現(xiàn)使用SIRT1的抑制劑也具有神經(jīng)保護的作用,提示SIRT1可能在一些模型中發(fā)揮有害的作用。這一看似矛盾的結(jié)論使SIRT1在神經(jīng)元損傷中的作用更加不明朗。因此,闡明SIRT1在TBI中的生物學(xué)功能及相關(guān)的分子調(diào)控機制對于利用SIRT1作為神經(jīng)保護治療的靶點非常重要。
　　實驗?zāi)康模?br>　　(1)明確 SIRT1在 TBI后表達的變化規(guī)律及生物學(xué)功能;(2)探索 SIRT1與 MAPK/E

4、RK通路之間的相互調(diào)節(jié)機制及在 TBI中的作用;(3)探索 SIRT1和homer1a之間在TBI后的相互調(diào)控及發(fā)揮保護作用的可能機制。
　　實驗方法：
　　(1)細(xì)胞培養(yǎng):胎鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)及鑒定;(2)模型建立:建立離體機械性損傷模型和小鼠重物下落閉合性腦損傷模型模擬離體及在體條件下的創(chuàng)傷性腦損傷;(3)分子表達及定位:分別采用Western blot、免疫熒光及免疫組化等方法檢測各種分子的表達及空間定位;(4)神經(jīng)

5、元損傷評估:采用 LDH試劑盒和PI/Hoechst活細(xì)胞染色檢測神經(jīng)元損傷程度;(5)腦損傷評估:利用神經(jīng)功能學(xué)評分()檢測TBI后小鼠腦損傷的程度;(6)細(xì)胞凋亡:cleaved Caspase-3檢測或TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡;(7)SIRT1調(diào)控:利用SIRT1抑制劑salermide及siRNA的方法下調(diào)SIRT1在神經(jīng)元的表達,采用SIRT1激動劑白藜蘆醇上調(diào)SIRT1的活性或表達;(8)MAPK/ERK通路調(diào)控:使用 E

6、RK特異性阻斷劑PD98059和U0126抑制MAPK/ERK通路的激活;(9)Homer1a調(diào)控:利用慢病毒包裝 homer1a過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元上調(diào)Homer1a在離體培養(yǎng)的神經(jīng)元中的表達。
　　實驗結(jié)果：
　　實驗一:離體神經(jīng)元機械性損傷模型可顯著增加TBI后神經(jīng)元中LDH的釋放;TUNEL染色顯示:TBI后24h神經(jīng)元中的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加;Western blot檢測活化的caspase-3的表達在損傷后早期即出

7、現(xiàn)明顯升高,并在損傷后期逐漸回落至正常水平。在小鼠重物下落閉合性腦損傷模型中:TBI后小鼠的血糖水平從損傷后3h開始顯著升高,在損傷后5天恢復(fù)正常;TUNEL染色顯示TBI后12h損傷側(cè)皮層中TUNEL染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加;活化的caspase-3在損傷后3h表達增加,并在3d后恢復(fù)正常水平;免疫熒光染色顯示 TBI后損傷側(cè)皮層中活化的caspase-3表達較對照組顯著升高,進一步證實了TBI后損傷側(cè)皮層中凋亡神經(jīng)元的數(shù)量增加。

8、此外,離體和在體的研究均顯示:TBI后神經(jīng)元中SIRT1的表達顯著增加,之后逐漸恢復(fù)到正常水平。免疫組化染色顯示TBI后SIRT1表達較對照組顯著增加,主要定位在損傷側(cè)皮層和海馬部位神經(jīng)元的胞漿和軸突中。
　　實驗二:創(chuàng)傷性腦損傷可引起離體神經(jīng)元和動物腦組織中 MAPK/ERK通路的激活。在離體機械性損傷模型中:加入不同濃度的SIRT1抑制劑 salermide后可顯著降低神經(jīng)元的存活率,同時神經(jīng)元中 LDH的釋放顯著增加且呈濃度

9、依賴性;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)加入salermide抑制了神經(jīng)元中SIRT1的表達后,ERK通路的激活受到顯著抑制,同時活化的caspase-3的表達顯著升高;采用siRNA的方法干涉離體神經(jīng)元中SIRT1的表達后,ERK通路的激活受到抑制,同時活化的caspase-3顯著增加,這一結(jié)果和神經(jīng)元加入抑制劑后的結(jié)果一致。采用立體定向的方法向小鼠側(cè)腦室注射不同濃度的salermide后建立在體TBI模型,發(fā)現(xiàn) TBI后小鼠損傷側(cè)皮

10、層神經(jīng)元中 SIRT1的表達抑制后,ERK通路的激活也受到明顯抑制,而小鼠的NSS評分顯著增加。為了觀察TBI后MAPK/ERK通路的激活是否調(diào)節(jié)SIRT1的表達,我們采用ERK通路的抑制劑PD98059預(yù)處理離體培養(yǎng)的神經(jīng)元中后行機械性損傷,當(dāng)神經(jīng)元中 MAPK/ERK通路的激活受到顯著抑制后,SIRT1的表達和對照組相比也被明顯抑制,同時活化的caspase-3的表達也受到抑制。TUNEL染色顯示在加入PD98059的神經(jīng)元中,TB

11、I后TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)較加入DMSO組顯著降低。在體的實驗同樣證實:抑制TBI后 ERK通路的激活可以顯著降低損傷側(cè)皮層SIRT1的表達,同時小鼠的NSS評分也顯著降低。此外,關(guān)于TBI后高糖血癥的研究顯示:TBI后,小鼠尾靜脈血中血糖水平明顯升高,5d后恢復(fù)至正常水平。采用側(cè)腦室注射的方式抑制小鼠腦組織中ERK通路的激活可以顯著降低TBI后的血糖水平的升高,而側(cè)腦室注射 SIRT1抑制劑 salermide后小鼠尾靜脈血中的血

12、糖水平較對照組明顯升高。
　　第三部分:離體和在體的研究均證實:TBI后神經(jīng)元中即早基因homer1a的表達明顯增高,在達到高峰后逐漸恢復(fù)至正常水平,而homer1b/c的表達比較穩(wěn)定。離體和在體的免疫熒光染色顯示TBI后 homer1a和p-ERK主要表達在神經(jīng)元中,且共定位于神經(jīng)元的胞漿和軸突。采用siRNA抑制SIRT1表達后,homer1a的表達明顯受到抑制,同時β-catenin的表達也受到抑制;而使用SIRT1的激動劑

13、白藜蘆醇預(yù)處理神經(jīng)元后,SIRT1表達增加的同時,homer1a及β-catenin的表達也顯著增加。此外,離體和在體的研究證實,抑制 MAPK/ERK通路的激活可以顯著降低TBI后Homer1a表達的增加。同時我們使用慢病毒包裹的homer1a過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元發(fā)現(xiàn),機械性損傷后離體培養(yǎng)的神經(jīng)元中TUNEL染色陽性的細(xì)胞數(shù)明顯減少,提示 homer1a過表達具有神經(jīng)保護的作用。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒組的神經(jīng)

14、元中homer1a和β-catenin的表達增加,而SIRT1和p-ERK的表達受到明顯抑制。提示外源性的homer1a可能對TBI后神經(jīng)元中SIRT1的表達存在負(fù)反饋的作用。
　　實驗結(jié)論：
　　本課題的研究結(jié)果證實,TBI后 SIRT1和 homer1a作為內(nèi)源性的神經(jīng)保護因子,其表達升高發(fā)揮神經(jīng)保護的作用;SIRT1可能通過與 MAPK/ERK通路的相互作用來調(diào)節(jié)homer1a的表達,SIRT1與Homer1a相互作用