中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應(yīng)中作用機制的研究.pdf

1、研究背景:創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科常見急癥之一，也是兒童和青壯年死亡和致殘的重要原因，尤其是中、重型顱腦外傷對患者的生存時間、神經(jīng)功能的影響巨大，且TBI后常常會伴發(fā)其他系統(tǒng)的功能障礙，嚴(yán)重時甚至可導(dǎo)致并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dysfunc

2、tion syndrome，MODS)，給社會和家庭帶來嚴(yán)重的醫(yī)療和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。盡管近十年來，顱腦外傷的基礎(chǔ)和臨床研究取得了很大的進步，新的理論不斷產(chǎn)生和發(fā)展，但是目前仍然沒有明顯有效的治療措施能減少死亡率和致殘率。TBI后的病理生理過程至今仍然不完全清楚，目前已知的是TBI后腦的損傷可分為兩個階段，即初始損傷階段和繼發(fā)性損傷階段。初始階段是指損傷本身，由直接的頭顱撞擊或者加速性、減速性損傷引起的;第二階段則從損傷開始持續(xù)到接下來的幾天或

3、者幾個星期，為了修復(fù)損傷組織的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這個遲發(fā)的階段將進行一系列的生理學(xué)、細(xì)胞及分子層面的反應(yīng)。第二階段如果沒有得到良好的控制，則會導(dǎo)致繼發(fā)性損傷。TBI后，原發(fā)性損傷將觸發(fā)一系列病理級聯(lián)過程，包括激活炎癥反應(yīng)、產(chǎn)生氧自由基、釋放興奮毒性神經(jīng)遞質(zhì)、激活細(xì)胞內(nèi)各種酶。這些可導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞和激活細(xì)胞凋亡途徑。
　　 炎癥反應(yīng)在TBI后的繼發(fā)性腦損傷中具有重要的地位，而核因子-kappa B(nuclear factor kapp

4、a B，NF-κB)作為核轉(zhuǎn)錄因子，已被證明在TBI后對炎癥反應(yīng)的調(diào)控中具有重要的作用，其主要參與對其下游的炎癥因子、趨化因子、急性期蛋白、促細(xì)胞凋亡/抗凋亡蛋白等基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。目前已知有多條信號通路參與了對NF-κB結(jié)合活性的調(diào)控，其中Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)/髓樣分化初級反應(yīng)蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88，M

5、yd88)/NF-κB信號通路就是其中比較重要的一種。作為TLRs信號通路的關(guān)鍵性連接蛋白，Myd88主要參與對NF-κBDNA結(jié)合活性的調(diào)控。抑制Myd88之后，可以明顯減少NF-κB的結(jié)合活性，NF-κBDNA結(jié)合活性受抑制后可以明顯抑制下游的炎癥因子的表達(dá)。TBI后各種炎癥因子如白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis

6、 factor-α，TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）等明顯升高且呈持續(xù)高表達(dá)，可以促進循環(huán)中的炎癥細(xì)胞如多形核嗜中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)向腦組織中募集和浸潤，TBI后PMNs在腦組織中的浸潤已經(jīng)被大量的基礎(chǔ)和臨床所證實。浸潤的PMNs釋放出大量氧化自由基、細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白酶，其中

7、細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白酶包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、蛋白酶3(proteinase3，PR3)、組織蛋白酶G(cathepsinG，CG)。具有多種生物活性的NE異常和過量釋放進入組織后可直接導(dǎo)致急性炎癥進展和（或）慢性炎癥疾病。
　　 NE屬于糜蛋白酶超家族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，PMNs釋放的彈性蛋白酶在腦損傷中具有多種作用，包括破壞血腦屏障(blood-brain barrier，BB

8、B)，引起血管源性腦水腫;促進炎癥細(xì)胞向腦血管、實質(zhì)浸潤;誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。但有關(guān)NE發(fā)揮這些作用的具體機制，目前并不十分清楚。因而通過對NE在TBI后對腦損傷的所起作用的研究可以進一步明確繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展的過程。同時NE特異性抑制劑，ONO-5046在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中均被證實具有一定的保護作用，了解NE在腦損傷中的作用機制也可以為臨床新藥的開發(fā)提供相關(guān)的理論依據(jù)。
　　 目的:通過觀察NE特異性抑制劑ONO-5

9、046對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后皮層Myd88的表達(dá)、NF-κBDAN結(jié)合活性、下游炎癥因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1的轉(zhuǎn)錄的影響以及對PMNs浸潤的影響，明確NE對TBI在繼發(fā)性腦損傷中作用的可能機制。
　　 方法:
　　 1.分組及模型
　　 將54只C57BL/6成年雄性小鼠(25～30g)隨機等分成三組:對照組(Control組,n=18)、腦外傷組(TBI組，n=18)、腦外傷+ONO-5046組(

10、TBI+ONO-5046組，n=18)。創(chuàng)傷性腦損傷模型采用改良的小鼠閉合性腦損傷模型（333g圓柱形撞擊錘從2.5cm高度沿垂直金屬桿自由下落），對照組小鼠僅行頭皮切開，不做頭顱打擊。TBI+ONO-5046組傷后立即給予腹腔注射ONO-5046溶液，根據(jù)每只小鼠體重確保ONO-5046的最終注射量分別為50mg/Kg，傷后24h和48h再腹腔注射相同體積的ONO-5046溶液，對照組和TBI組僅給予相當(dāng)體積的PBS緩沖液。對照組和T

11、BI組傷后1h行NSS評分。致傷后72小時，每組隨機取12只小鼠經(jīng)左心室插管灌注40ml0.01molPBS緩沖液后斷頭取腦，切取損傷灶周圍5mm的腦組織保存于-80℃，其中每組6只小鼠用于westernblot和real-timePCR檢測，剩余6只用于髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性檢測。每組再取6只小鼠經(jīng)上述同樣路徑行4％多聚甲醛灌注(約30ml)，斷頭取腦，脫水后石蠟包埋4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2

12、.胞漿蛋白和胞核蛋白提取
　　 將創(chuàng)傷灶周邊皮層腦組織取出剪碎，加入800μl蛋白裂解液A液，研磨勻漿，冰浴振蕩1h。加入NP-4050μl，輕搖30sec后，13000rpm離心10min，取上清（內(nèi)含胞漿蛋白），儲存于-80℃用于westernblot實驗。向沉淀中加入細(xì)胞裂解液B液200μl，充分混勻，冰浴振蕩2h，13000rpm離心10min，取上清（內(nèi)含胞核蛋白）儲存于-80℃用于用于凝膠電泳遷移率實驗。然后根據(jù)BC

13、A蛋白定量試劑盒提供的方法進行蛋白定量，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書操作。
　　 3.WesternBlot檢測Myd88蛋白表達(dá)
　　 取胞漿蛋白，按體積比4/1加入loadingbuffer，95℃水浴5min。選用10％SDS-PAGE凝膠，每孔上樣50μg（10μl）。凝膠電泳(濃縮膠120V，分離膠60V)后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(100V，90min)。甲醇浸泡1min后，5％脫脂奶粉(TBST稀釋)室溫下封閉2

14、h，加入兔抗小鼠Myd88多克隆抗體(1/1000)、兔抗小鼠β-actin單克隆抗體(1/1000)4℃孵育過夜。洗脫，用山羊抗兔IgG二抗(1/1000)室溫孵育2h。使用ECL(1/1)化學(xué)發(fā)光檢測，曝光、顯影、定影。
　　 4.凝膠電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)法檢測NF-κB結(jié)合活性
　　 參照試劑盒內(nèi)說明書進行操作:取1.75pmol/μl

15、未標(biāo)記的雙鏈NF-κB寡核苷酸探針(5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3')和T4多核苷酸激酶，用[γ-32P]ATP進行標(biāo)記，總反應(yīng)體積為14μl（其中核蛋白40μg，[γ-32P]ATP標(biāo)記的NF-κB探針2μl，loading buffer 2 μl，4 μl緩沖液，余為自由水），混勻后室溫放置10min，預(yù)電泳(250V)10min。上樣于聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中，恒壓350V電泳90min。電泳結(jié)

16、束后輕輕揭下凝膠，烤箱烘干2h，放人暗盒中-80℃曝光、顯影，采用ImageJ圖像分析軟件測量顯色陽性區(qū)的平均灰度值。
　　 5.實時PCR(real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)檢測Myd88、TNF-α、IL-1β、ICAM-1mRNA表達(dá)水平
　　 按每50～100mg腦組織加1mlTrizol試劑進行組織勻漿，在去RNA酶環(huán)境下提取總RNA后，用核酸測

17、定儀檢測RNA濃度(OD260/280比值)，提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-timePCR20μl反應(yīng)體系（2μlcDNA，0.4μl ROX Reference Dye，10μl SYBR Green I，1μl引物，余為DDH2O），95℃30sec變性，反應(yīng)條件:變性95℃，5sec;退火62℃，34sec，40個循環(huán)。讀取CT值，與β-actin對比后求出目的RNA的△CT值。
　　 6.免疫組織化學(xué)

18、(immunohistochemistry，IHC)檢測Myd88在傷側(cè)腦皮層中的表達(dá)
　　 4％多聚甲醛溶液浸泡的腦組織，以損傷灶為中心，常規(guī)石蠟包埋后進行連續(xù)切片，切片厚度4μm，脫蠟，水化，抗原修復(fù)后，正常動物非免疫血清封閉。加入兔抗小鼠Myd88—抗4℃孵育過夜(一抗稀釋比例1/100)，洗片后加入1.6％H2O2封閉10min，再加入HRP標(biāo)記二抗室溫下孵育60min后，DAB顯色。每張切片隨機選取6個高倍視野(×40

19、0)觀察陽性細(xì)胞個數(shù)，求平均值后統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 7.傷側(cè)腦皮層中MPO活性檢測
　　 稱取100mg損傷灶周圍腦組織，嚴(yán)格按照試劑說明書進行組織勻漿準(zhǔn)備，取0.1ml組織勻漿加入試劑三0.9ml混勻后37℃水浴15min。設(shè)置對照管和測定管，其中對照管中加入蒸餾水3ml、勻漿樣本0.2ml、試劑四0.2ml，測定管中加入勻漿樣本0.2ml、試劑四0.2ml、顯色劑3ml。充分混勻后，放置37℃水浴30min，再向上述

20、兩管中各加入試劑七0.05ml，試劑添加完成后再次混勻，放置60℃水浴10min，取出后立即在全光譜分光光度計，中心波長調(diào)至460nm處，測各管吸光度。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料結(jié)果以例數(shù)、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。僅對兩獨立組均數(shù)進行比較時，方差齊性采用成組t檢驗，若方差不齊采用Satterthwaiter校正t檢驗。多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計

21、學(xué)意義時進行兩兩組間多重比較，若方差齊性，采用LSD檢驗，若方差不齊用Dunnett'sT3檢驗。以P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.大體觀察和與NSS評分:試驗中所有54只C57BL/6雄性小鼠均來自同一批次，各組小鼠體重?zé)o顯著差異。外傷模型制作和給藥過程中，操作步驟一致。其中TBI和治療組均無死亡，外傷組和治療組NSS評分結(jié)果無顯著差異。
　　 2.腦組織Myd88mRNA表達(dá)的變化

22、:實時熒光定量PCR結(jié)果顯示各組間的mRNA表達(dá)水平方差不齊(P=0.016)，組間的差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(Welch=185.905，P=0.000)，其中，TBI后挫傷灶周圍腦組織中Myd88mRNA表達(dá)較對照組顯著升高(P＜0.05)，在給予ONO-5046治療的TBI+ONO-5046組，Myd88mRNA表達(dá)水平相對于TBI組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.腦組織Myd88蛋白表達(dá)的變化:

23、WesternBlot結(jié)果顯示各組的相對灰度值方差齊性(P=0.459)，組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=53.276，P=0.000)。其中，TBI后挫傷灶周圍腦組織中Myd88蛋白含量較顯著升高，同PCR結(jié)果一樣，在TBI+ONO-5046組相較于TBI組Myd88蛋白含量顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.免疫組織化學(xué)顯示Myd88在腦組織中的變化:IHC結(jié)果顯示各組間的Myd88陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果方差

24、齊性（P=0.112），組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=67.152，P=0.000)，其中，Myd88在正常小鼠腦組織中也具有一定的表達(dá)（10.00±2.23/單個視野），TBI后Myd88這種表達(dá)明顯升高，相對于對照組陽性細(xì)胞顯著增多（38.83±3.77/單個視野）(P＜0.05)，TBI+ONO-5046組陽性細(xì)胞相較于TBI組顯著降低(25.33±6.15/單個視野)（P＜0.05）。
　　 5.腦組織NF-κBDNA結(jié)

25、合活性的變化:EMSA結(jié)果顯示各組間的結(jié)果方差齊性(P=0.680)，組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.263，P=0.000)，TBI后挫傷灶周圍腦組織中NF-κBDNA結(jié)合活性較對照組顯著升高（P＜0.05），在給予ONO-5046治療的TBI+ONO-5046組，NF-κBDNA結(jié)合活性較TBI組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.腦組織TNF-α、IL-1β和ICAM-1mRNA表達(dá)的變化:PCR結(jié)

26、果顯示TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平那個各組間的結(jié)果方差均不齊（P值分別為0.002，0.000，0.003），組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Welch值分別為342.881，90.368，410.643;P值均為0.000），TNF-α、IL-1β和ICAM-1的mRNA表達(dá)水平在TBI后顯著升高，相對于對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，給予ONO-5046治療后，相對于TBI組TNF-α、IL-1β和IC

27、AM-1轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 7.PMNs浸潤水平的變化:MPO活性檢測結(jié)果顯示各組間的結(jié)果方差齊性(P=0.148)，組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=64.400，P=0.000)，其中，TBI組挫傷灶周圍腦組織中MPO的活性顯著升高，達(dá)到1.36±0.22(U/g)，而對照組僅0.33±0.14(U/g)，TBI+ONO-5046組的結(jié)果為0.97±0.09(U/g)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)

28、差異(P＜0.05)，間接提示TBI后PMNs向腦組織中浸潤明顯升高，ONO-5046治療可以明顯抑制PMNs向腦組織中的浸潤。
　　 結(jié)論:免疫炎癥反應(yīng)在TBI后繼發(fā)性腦損傷中具有重要作用。TBI后PMNs大量浸潤在多種刺激因素的作用下釋放大量的NE，過量的NE釋放進入腦組織后可以加劇繼發(fā)性腦損傷。NF-κB處于炎癥反應(yīng)的核心部位，對TBI后的炎癥反應(yīng)的進展具有重要的作用。Mydg8作為NF-κB上游重要的調(diào)節(jié)因子，對NF-κ