IL-6與GM-CSF基因融合表達(dá)生長(zhǎng)抑素基因疫苗對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響.pdf

1、白細(xì)胞介素-6(IL-6)是常用的免疫增強(qiáng)劑。為了探討其在基因免疫中的免疫增強(qiáng)作用，本研究應(yīng)用基因克隆、細(xì)胞培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫測(cè)定、RT-PCR等技術(shù)，首先克隆了牛的IL-6基因，在生長(zhǎng)抑素DNA疫苗pGS/2SS-asd基礎(chǔ)上插入牛的IL-6基因，構(gòu)建非抗性篩選生長(zhǎng)抑素真核表達(dá)質(zhì)粒pGS/2SS-IL6-asd，并電轉(zhuǎn)化至缺失asd基因的減毒豬霍亂沙門氏菌，將重組菌肌注免疫小鼠后，旨在：①探討IL-6和GM-CSF融合表達(dá)對(duì)生長(zhǎng)抑素DNA

2、疫苗免疫反應(yīng)和增重效果的影響；②評(píng)估其安全性，為開發(fā)安全、高效的促生長(zhǎng)DNA疫苗，加快其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 1.牛IL-6基因克隆和序列分析
　　 用ConA、PHA體外刺激誘導(dǎo)牛外周血單核細(xì)胞(PBMC)，提取單核細(xì)胞總RNA后，利用RT-PCR克隆牛IL-6基因。序列分析表明，牛IL-6基因cDNA開放閱讀框?yàn)?24bp，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中登載的牛IL-6序列(序列號(hào)：X57317.1)進(jìn)行序列比較，結(jié)果

3、有99.84％的同源性。將牛的IL-6基因插入T載體(pEASY-Tl-simple)保存。
　　 2.非抗性篩選生長(zhǎng)抑素真核表達(dá)質(zhì)粒pGS/2SS-IL6-asd的構(gòu)建與鑒定
　　 將牛IL-6基因插入到pGS/2SS-asd質(zhì)粒的下游，構(gòu)建帶有IL-6和GM-CSF融合表達(dá)的非抗性篩選生長(zhǎng)抑素真核表達(dá)質(zhì)粒pGS/2SS-IL6-asd。酶切、測(cè)序鑒定結(jié)果表明，基因的插入位點(diǎn)、方向、序列完全正確。RT-PCR結(jié)果表明，

4、pGS/2SS-IL6-asd質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后能檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
　　 3.非抗性篩選生長(zhǎng)抑素DNA疫苗pGS/2SS-IL6-asd免疫小鼠的免疫反應(yīng)和促生長(zhǎng)效果
　　 將所構(gòu)建的質(zhì)粒pGS/2SS-asd電轉(zhuǎn)化至缺失asd基因的減毒豬霍亂沙門氏菌C500，獲得非抗性篩選生長(zhǎng)抑素DNA疫苗C500(pGS/2SS-asd)。將50只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為6組，A、B、C三組分別用3種劑量（1×1010CFU/只，1×

5、109CFU/只，1×108CFU/只）pGS/2SS-IL6-asd疫苗進(jìn)行免疫；D組免疫不帶IL-6的C500基因疫苗，即pGS/2SS-asd，劑量為109cfu/mL；E組免疫沙門氏菌空菌C500(109cfu/mL)，F(xiàn)組免疫PBS。各組免疫方式均為肌肉注射，體積為0.2mL。在首次免疫后，第2周，用同等劑量的疫苗或?qū)φ找哼M(jìn)行加強(qiáng)免疫一次。并分別在0（初次免疫前）、14（二免前）、28、42和56天同一時(shí)段采血。ELISA結(jié)果

6、顯示，A、B、C、D組小鼠均可以檢測(cè)到抗SS抗體，且隨免疫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。pGS/2SS-IL6-asd高劑量組和中劑量組取得了較高的抗體水平，極顯著高于低劑量組和pGS/2SS-asd組(p＜0.01)。每周稱量小鼠體重，發(fā)現(xiàn)pGS/2SS-IL6-asd高劑量組增重效果明顯高于低劑量組和pGS/2SS-asd組。綜上所述，IL-6和GM-CSF融合表達(dá)對(duì)生長(zhǎng)抑素DNA疫苗有一定的免疫增強(qiáng)作用，pGS/2SS-IL6-as