生長抑素對前列腺癌蛋白表達特性的影響.pdf

1、研究背景：前列腺癌在美國是最常見的實體惡性腫瘤。2005年約有23.2萬前列腺癌新病例并有近3萬前列腺癌病人死亡。通常在亞洲尤其在中國的前列腺癌發(fā)病率最低，但近年發(fā)病率呈明顯上升趨勢。局限性或轉(zhuǎn)移性的前列腺癌標準的初始治療是雄激素去勢治療(Androgen Deprivation Therapy,ADT)，可采用雙側(cè)睪丸切除或促黃體生成素釋放激素(Luteinizing Hormone-Releasing Hormone，LHRH)治療

2、。轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者對于雄激素依賴(Androgen Dependence)通常約14-30個月，然后進展為對雄激素非依賴性狀態(tài)(Aaadrogen-IndependenceProstate Cancer，AIPC)。在此期間，盡管雄激素維持在去勢水平，但對ADH治療無效。部分病人對二次激素治療仍有反應(yīng)，隨后即失去對激素的反應(yīng)性，進入激素難治性(Hormone Refractory Prostate Cancer,HRPC)狀態(tài)。處于A

3、IPC和HRPC狀態(tài)的患者可以有各種不同的表現(xiàn)，如前列腺特異性抗原(Prostatic SpecificAntigen，PSA)升高，伴隨或者不伴隨轉(zhuǎn)移，影像學(xué)改變，包括骨掃描或軟組織浸潤以及加重的臨床癥狀，如疼痛加劇，排尿梗阻加重。 前列腺癌激素轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)機制尚不完全明了。前列腺癌激素非依賴性表型的獲得是前列腺癌治療的最嚴重的問題。盡管已有數(shù)個實驗?zāi)Ｐ涂捎脕磉M行激素依賴性研究，但其在激素非依賴性研究中的應(yīng)用受限。LNCa

4、P是一個人前列腺癌細胞系，常常被用來進行各種體外實驗。該細胞系是自前列腺癌轉(zhuǎn)移的鎖骨上淋巴結(jié)分離而來，表達雄激素受體(Androgen Receptor,AR)，呈現(xiàn)對雄激素敏感的生長狀態(tài)。盡管在培養(yǎng)液中雄激素的活性水平與生理狀態(tài)相當(dāng)，但隨著的LNCaP傳代，它的生長將逐漸失去對雄激素的依賴性，很好地模擬前列腺癌臨床進展過程，是一個非常理想的前列腺癌實驗?zāi)Ｐ?。近年來發(fā)現(xiàn)，生長抑素(Somatostatin,sms)以及其類似物能夠通過數(shù)

5、種調(diào)節(jié)機制來抑制前列腺癌的生長，通過抑制生長激素、胰島素等分泌，通過與生長抑素受體1-5(somatostatin receptor,sstr)的結(jié)合，抑制細胞的有絲分裂，從而抑制細胞的生長。激素非依賴性前列腺癌表達sstr受體。sms類似物，如奧曲肽(Octreotide)目前僅有少量臨床實驗，且僅表現(xiàn)出有限的作用。HRPC主要表達sstr1受體，而奧曲肽僅作用于sstr2和sstr5，這也是為什么奧曲肽在前列腺癌的治療中受限的可能原

6、因。生長抑素類似物與sstr1的高度親和性成為治療HRPC的一個有效的選擇。最近我們報道了一種新的奧曲肽類似物(smsdx)，具有和sstr1-5受體廣泛的親和性，這種新藥物是基于天然生長抑素(sms14)而開發(fā)的。體外實驗和動物實驗顯示生長抑素類似物能夠抑制前列腺癌細胞的生長。應(yīng)用前列腺癌細胞系LNCaP的實驗也提示生長抑素對LNCaP的細胞增殖和蛋白分泌有抑制作用，該作用是通過激活蛋白酶phosphotyrosyl protein

7、phosphatases實現(xiàn)的。 在后基因組時代，生物學(xué)的中心任務(wù)是認識基因組的功能。由于基因功能主要是通過其表達蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的，要了解基因的全部信息，必須深入研究不同基因編碼的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中已具有重要的地位。腫瘤蛋白組學(xué)(Oncoproteomics)是應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)研究腫瘤細胞中的蛋白以及其相互關(guān)系到學(xué)科。腫瘤細胞或組織蛋白質(zhì)樣本通常經(jīng)過雙向電泳等技術(shù)可以按不同大小分子量、等電點或類型得以分離(Pr

8、ofiling)，然后通過質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較，進一步將特殊的感興趣的蛋白質(zhì)鑒定出來。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)是整個蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一項重要內(nèi)容，通過蛋白質(zhì)組分析技術(shù)將能夠從細胞整體水平上認識在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中蛋白表達譜的變化，為尋找特異的腫瘤標志物這一研究領(lǐng)域帶來了新的希望。腫瘤蛋白組學(xué)有可能為臨床實踐帶來根本性的改革,包括腫瘤診斷、基于蛋白組學(xué)平臺的作為組織病理學(xué)補充的腫瘤篩選、個性化治療方案組合的選擇、腫瘤特異性蛋白靶目標的確

9、定、實時評估治療效果和藥物毒性、依據(jù)與腫瘤預(yù)后及耐藥相關(guān)的腫瘤蛋白調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)合理地調(diào)節(jié)治療方案。 材料和方法：為了了解和闡明sms以及smsdx的分子水平作用機制，我們采用蛋白組學(xué)分析方法進行研究。首先用sms以及smsdx處理LNCaP細胞，1nM3天。然后按照標準的雙相凝膠(2-Dimansional Electrophoresis,2-DE)電泳方法進行蛋白的提取，濃度測定，蛋白裂解。固定膠條(Immobilized pH

10、Gradients,IPG)的使用，不僅提高了胞內(nèi)蛋白的分離效率，而且增加了雙相電泳的可重復(fù)性。本實驗采用11cm的IPG strip(pH3-10)進行一相蛋白分離，應(yīng)用12.5％的Tris-HCI成品膠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進行雙相蛋白的分離，采用敏感的銀染方法(SilverStaining)進行染色，掃描圖像，用PDQuest軟件系統(tǒng)進行定量分析，采用T-studentTest和Mann-Whitney進行統(tǒng)計學(xué)分析，找出差異表達的蛋

11、白，以sms處理組作為陽性對照，未用藥物處理組作為陰性對照，來確定sms和smsdx對前列腺癌細胞蛋白表達的差異性和共同性。然后采用基質(zhì)激光輔助的解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry.MALDI-TOF-MS)分析方法，對受影響的蛋白質(zhì)進行定性分析，通過與資料庫的對照研究，確定相關(guān)蛋白，從而來確定前

12、列腺癌激素依賴性轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)蛋白以及可能的調(diào)節(jié)途徑。 結(jié)果： 1.在用1nM sms和smsdx處理前列腺癌細胞系LNCaP 3天以后，掃描獲取銀染的凝膠圖像，應(yīng)用PDQuest軟件系統(tǒng)進行分析。首先檢測3組膠以及每組膠成員之間的相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient)位于0.85-0.92之間，顯示出高度的可重復(fù)性。3個樣本組(陰性對照組，sms陽性對照組以及smsdx處理組)顯示出對蛋白影響的共同性和

13、差異性。在smsdx處理組中，與陽性對照組(sms處理組)比較，我們發(fā)現(xiàn)有63個蛋白點上調(diào)表達(高于2倍)(P值小于0.05)。在smsdx處理組中，與陰性對照組比較，我們發(fā)現(xiàn)有489個蛋白點下調(diào)表達(高于2倍)。在sms處理組中，44個蛋白點上調(diào)表達(高于2倍)(P值小于0,05)，有386個蛋白點下調(diào)表達(高于2倍)。在上調(diào)表達的63個蛋白點中，有24個蛋白點受sms和smsdx共同上調(diào)表達(高于2倍)，約占33,33％。受sms和

14、smsdx影響，有295個蛋白點共同下調(diào)表達(高于2倍)。 2.本實驗有三個組，陰性對照組，陽性對照組(sms組)，smsdx處理組。通過PDQuest軟件系統(tǒng)進行分析，應(yīng)用Mann-Whitney方法檢測，采用MALDI-TOF-MS/MS方法有172個蛋白點(protein spot)得到分析，共鑒定出140種蛋白質(zhì)。這是由于蛋白質(zhì)的同構(gòu)異功體的存在所致。參照蛋白基因信息資料庫Swiss-Prot，Genome Brower

15、以及National Center for Biotechnology Information(NCBI)等進行生物信息分析，按照這些蛋白已知的生化功能，如代謝、信號傳導(dǎo)、細胞結(jié)構(gòu)的維護、細胞間反應(yīng)、運輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及細胞周期調(diào)節(jié)等對鑒定出的蛋白質(zhì)進行分類。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體及線粒體相關(guān)蛋白明顯受sms和smsdx的影響，大部分出現(xiàn)上調(diào)表達(高于2倍)。與細胞凋亡有關(guān)的蛋白則出現(xiàn)上調(diào)表達(如VDAC1，VDAC2)，有出現(xiàn)下調(diào)表達(如PR

16、DX2,TCTP)。PRDX2蛋白的表達變化高于2倍，而其他蛋白則低于2倍。sms和smsdx引發(fā)的線粒體蛋白的上調(diào)似乎也影響到細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。 3.在前列腺癌種蛋白在前列腺癌激素依賴性細胞系LNCaP的培養(yǎng)過程中，對細胞系行逐漸的去激素化培養(yǎng)，我們最終建立了對激素非依賴性細胞系LNCaP-s?；谖覀兘⒌牧邢侔┘に匾蕾囆约毎礚NCaP蛋白資料庫，共鑒定出22種線粒體蛋白和22種腫瘤相關(guān)蛋白。通過文獻檢索和查尋蛋白信

17、息庫，發(fā)現(xiàn)16種蛋白可作為與腫瘤相關(guān)的候選標記物。其中11種蛋白在前列腺癌激素依賴性細胞系LNCaP中與激素非依賴性細胞系中有明顯的差異性表達。 結(jié)論： 1.生長抑素類似物(smsdx)在對蛋白表達水平的影響上具有與生長抑素類似的作用。該研究結(jié)果顯示出生長抑素類似物的效果和細胞在分子水平的反應(yīng)。蛋白組學(xué)技術(shù)是一種可靠的能夠鑒定出各種多肽的先進手段，為臨床上腫瘤標記物的鑒定提供了可靠的保證。 2.生長抑素以及生長抑

18、素類似物(smsdx)，能夠共同調(diào)節(jié)前列腺癌細胞系LNCaP中的重要蛋白，表現(xiàn)出相似的作用機制和影響程度。鑒定出的線粒體及線粒體相關(guān)蛋白，在細胞凋亡過程中起著非常重要的作用。出現(xiàn)差異表達的相關(guān)腫瘤蛋白的鑒定，為篩選可靠的腫瘤標記物以及治療靶蛋白提供了有效的信息。 3.本課題組通過去激素化培養(yǎng)前列腺癌激素依賴性細胞系LNCaP，得到的對激素非依賴性細胞系LNCaP-s，為我們進一步認識和了解臨床前列腺癌激素依賴性轉(zhuǎn)化的機制提供了一