肌肉生長抑素基因的克隆、表達(dá)和基因工程疫苗的研制及在豬體上的應(yīng)用.pdf

1、肌肉生長抑制激素(myostatin，MSTN)是骨骼肌的負(fù)調(diào)控因子，是影響肌肉生 長與發(fā)育的重要因素。為了促進(jìn)豬生長后期肌肉的快速增長，就需要消除MSTN對肌 肉的負(fù)調(diào)控作用。本研究通過基因工程的手段，從獅頭鵝大腿肌肉中獲得MSTN作為 免疫原，并采用不同的免疫佐劑，制備了肌肉生長抑制激素的基因工程疫苗，對生長 肥育豬進(jìn)行主動免疫，使豬產(chǎn)生抗MSTN抗體，以頡頏體內(nèi)產(chǎn)生的肌肉生長抑制激素， 促進(jìn)豬肌肉的生長，并分別比較以油乳

2、劑和脂質(zhì)體為免疫佐劑的兩種疫苗免疫效果。 1．獅頭鵝肌肉生長抑制素基因成熟肽的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá) 根據(jù)擴(kuò)增的獅頭鵝的MSTN基因cDNA全長序列以及成熟肽序列，設(shè)計一對引 物，并分別在兩引物前設(shè)計2個酶切位點(diǎn)BamH I和Sac I，亞克隆獅頭鵝肌肉生長 抑制激素的成熟肽蛋白編碼基因，然后將特異性片段連接到pMD18-T載體，經(jīng)酶切、 PCR鑒定后，構(gòu)建了獅頭鵝原核單純表達(dá)載體pRSETA-MSTN-m，經(jīng)

3、測序鑒定表明所 克隆的MSTN成熟肽基因與Genebank上發(fā)表的雞(AF019621)、豬(AY208121)和 家鵝(AF440862)的MSTN-m核苷酸序列同源性分別可達(dá)到92％、88％、99％。而 翻譯后的成熟蛋白氨基酸序列與雞、豬和家鵝的同源性可以分別達(dá)到100％、100％及 99.1％，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組MSTN-m成熟蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，原核 表達(dá)產(chǎn)物為18.5KD的重組蛋白，為下一步制作促

4、進(jìn)豬肌肉生長的基因工程疫苗奠定 了基礎(chǔ)。 2．MSTN重組蛋白的變、復(fù)性研究及Western-blotting試驗(yàn) 在重組MSTN-m獲得表達(dá)的基礎(chǔ)上，收集誘導(dǎo)表達(dá)4h的大腸桿菌BL21(DE3)菌液，用高濃度的尿素液裂解及溶解包涵體，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，上清中有大量的表達(dá)的目的蛋白，然后經(jīng)過Ni<'2+>-NTAResin對帶有6個組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白純化， SDS-PAGE電泳顯示純化效果比較理想。隨后進(jìn)行

5、了Western-blotting試驗(yàn)鑒定，證實(shí) 所表達(dá)蛋白即為MSTN成熟肽蛋白，并具有免疫原性。 3．嶺南黃雞肌肉生長抑制素基因成熟肽的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)Genebank上登錄的雞的MSTN基因eDNA全長序列以及成熟肽序列設(shè)計一 對引物，并分別在兩引物前設(shè)計2個酶切位點(diǎn)EcoR I和Kpn I，亞克隆嶺南黃雞肌 肉生長抑制激素的成熟肽蛋白編碼基因，然后將特異性片段連接到pMDl8-T載體， 經(jīng)

6、酶切、PCR鑒定，構(gòu)建了嶺南黃雞真核單純表達(dá)載體pPICZaA-MSTN-m。經(jīng)測序鑒定表明所克隆的myostatin成熟肽基因與Genebank上發(fā)表的雞(AF019621)、豬(AY208121)和家鵝(AF440862)的MSTN-m核苷酸序列同源性分別可達(dá)到99％、92％、86％，而翻譯后的成熟蛋白氨基酸序列與雞、豬和家鵝的同源性分別為100％、99.1％及99.1％，說明該基因的成熟肽序列高度保守，具有重要的研究價值。真核表達(dá)

7、載體的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究該基因的功能及其酵母表達(dá)奠定基礎(chǔ)。4.不同佐劑制備的肌肉生長抑素基因工程疫苗對豬肌肉生長影響的研究通過大量表達(dá)MSTN蛋白，分別制備了以油乳劑和脂質(zhì)體為佐劑的肌肉生長抑制激素的基因工程疫苗，對豬進(jìn)行了MSTN的主動免疫。結(jié)果表明，MSTN基因工程疫苗可促進(jìn)豬的肌肉生長，用脂質(zhì)體作佐劑其效果更明顯。試驗(yàn)前后，脂質(zhì)體組平均日增重顯著高于對照組和油乳劑組(P＜0.05)，而對照組與油乳劑組間無顯著差異(P＞0.05)

8、。脂質(zhì)體組的料重比顯著低于對照組和油乳劑組(P＜0.05)。脂質(zhì)體組的眼肌面積極顯著大于對照組(P＜0.01)，但與油乳劑組差異不顯著(P＞0.05)。脂質(zhì)體組的瘦肉率顯著高于對照組(P＞0.05)，但與油乳劑組無顯著差異(P＞0.05)。油乳劑組的瘦肉率極顯著高于對照組(P＜0.01)。脂質(zhì)體組的肌纖維周長及面積極顯著大于對照組(P＜0.01)，并且顯著大于油乳劑組(P＜0.05)。結(jié)論：通過主動免疫M(jìn)STN蛋白，促進(jìn)了豬的肌肉生長，