基因I型戊型肝炎病毒ORF3抑制TNF-α誘導的核因子-κB信號機制研究.pdf

1、研究背景：
　　由于人們在20世紀80年代之前尚沒有認識到戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）的存在，故HEV被眾多學者稱為“被遺忘的病毒”。直到上世紀80年代，在蘇聯(lián)占領(lǐng)的阿富汗軍營中爆發(fā)了一種不明原因的肝炎，后來研究人員利用電鏡在志愿者的大便中發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒，經(jīng)基因測序，于1991年正式命名為HEV。近年來，隨著醫(yī)學檢測手段的不斷提高以及人們對其認識的不斷深入，HEV所引起的公共衛(wèi)生問題也逐漸成為科學界關(guān)

2、注的焦點。先前認為，HEV感染主要發(fā)生于基礎(chǔ)衛(wèi)生設(shè)施條件較差的發(fā)展中國家，但近年來，在歐美、日本等一些發(fā)達國家也出現(xiàn)了一些非輸入性本土化的HEV感染病例。目前，HEV感染呈全球分布，全世界每年約20億人感染HEV，約1400萬人為有癥狀者，每年約30萬人死于HEV感染，HEV感染占急性肝炎的50％以上，已成為全球急性病毒性肝炎的首要病因。自2012年開始至今，HEV在我國的感染及死亡總?cè)藬?shù)每年均超過甲型肝炎病毒（hepatitis A

3、virus,HAV）。傳統(tǒng)觀念認為，HEV感染后為一自限性過程，但在普通人群中仍有1-2%的患者發(fā)展為重型肝炎而導致死亡，孕婦感染HEV后可導致高達26.9%的死亡率，近年來在器官移植、腫瘤放化療及HIV感染者等一些免疫功能受到抑制的人群中出現(xiàn)了為數(shù)不少的慢性化病例的報道。因此，戊肝的防控形勢不容樂觀。盡管我國在2012年上市了全球第一支HEV疫苗，但HEV致病的確切機制并未得以詳細的闡明。
　　HEV是一單股正鏈RNA病毒，全長

4、約7.2kb，有3個開放讀碼框（ORF），4個基因型，1個血清型。其中，基因I型和II型主要感染人類，而III型和IV型為人畜共患性疾??；我國主要流行基因I型和IV型。研究發(fā)現(xiàn)，基因I型HEV感染后相較其它基因型HEV感染具有更高的病毒血癥和更嚴重的病情，但機制不明。由于缺乏成熟的小動物研究模型和體外細胞模型，目前對HEV致病機制的研究大多集中于對其基因組功能的分析上。HEV的ORF1和ORF2分別編碼HEV的非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白，OR

5、F3片段具體的功能目前尚沒有一致意見。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HEV ORF3蛋白抑制TNF-α誘導的p65入核，我們推測，ORF3蛋白可能通過調(diào)控宿主細胞核因子-κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB）信號為HEV復制優(yōu)化環(huán)境。本研究通過構(gòu)建HEV ORF3蛋白的真核表達質(zhì)粒，以人肺腺癌A549上皮細胞（A549）為載體，檢測HEV ORF3對細胞NF-κB信號的影響,從細胞水平進一步探討HEV OR

6、F3蛋白在TNF-α誘導的NF-κB信號調(diào)節(jié)中的具體作用及機制，初步揭示HEV感染后細胞內(nèi)信號異常與HEV致病的相關(guān)性，為闡明HEV的致病機制奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　在前期研究工作基礎(chǔ)上，進一步探討基因I型戊型肝炎病毒ORF3蛋白在TNF-α誘導的NF-κB信號轉(zhuǎn)導中的作用及調(diào)控機制，闡明基因I型HEV導致較高病毒血癥及較嚴重病程的具體機制。
　　實驗方法
　　1.根據(jù)已經(jīng)報道的巴基斯坦株Sar-55

7、（基因I型HEV）的cDNA序列中ORF3片段的序列，分別設(shè)計其上下游引物，采用PCR方法擴增出HEV ORF3片段，利用限制性內(nèi)切酶將ORF3片段連接在真核表達載體pEGFP-N1上，構(gòu)建帶有綠色熒光的ORF3真核表達質(zhì)粒（ORF3-GFP），基因測序及酶切鑒定正確；
　　2.將鑒定正確的ORF3-GFP融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞，48小時后，以TNF-α（50ng/ml）誘導NF-κB信號活化，通過蛋白印跡技術(shù)（Wester

8、n blot）分別檢測細胞漿和細胞核內(nèi)p65的表達水平，通過凝膠電泳遷移實驗（EMSA）檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性，分別以實時熒光定量PCR（real time PCR）和酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）檢測NF-κB下游分子的變化情況；
　　3.用Western blot檢測NF-κB經(jīng)典信號通路途徑中IKKβ的活性變化及IKBα的磷酸化水平的變化；以基因芯片技術(shù)（PCR Array）初步篩選ORF3-GFP作用于NF-κB信號通

9、路中的關(guān)鍵分子，并以real time PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平進行驗證；
　　4.設(shè)計并合成上述PCR Array中發(fā)現(xiàn)的負性調(diào)控基因的三條特異的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），進行干擾效果的初步評估，采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)干擾上述初篩的主要調(diào)控基因后，以熒光素酶報告基因活性檢測TNF-α誘導的NF-κB活性

10、的變化；
　　5.通過Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和非折疊蛋白反應(yīng)的標志蛋白，觀察A20分子表達與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)性；給予非折疊蛋白反應(yīng)的阻滯劑對細胞進行預處理，然后轉(zhuǎn)染ORF3-GFP，給予TNF-α干預，以熒光素酶報告基因活性檢測NF-κB活性。
　　實驗結(jié)果
　　1.成功構(gòu)建了基因I型HEV ORF3表達載體，將其轉(zhuǎn)染A549細胞，48小時后，熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光表達，以HEV ORF3單克隆抗

11、體行Western blot檢測，驗證了ORF3蛋白在A549細胞中成功表達，將構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)基因測序及酶切鑒定正確；
　　2.Western blot顯示，在沒有TNF-α刺激時，p65主要位于細胞漿內(nèi)，給予TNF-α刺激后，空白組及轉(zhuǎn)染空載體的A549細胞，p65出現(xiàn)了明顯的核轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)染了ORF3-GFP蛋白的細胞，給予TNF-α刺激后，細胞核內(nèi)p65的數(shù)量極少；
　　3.EMSA實驗表明，轉(zhuǎn)染GFP的細胞和未處理的細胞

12、給予TNF-α刺激后，與陽性對照組一樣，出現(xiàn)了蛋白-DNA復合物，而表達ORF3-GFP蛋白的細胞組即使給予TNF-α刺激，也未見蛋白-DNA復合物的出現(xiàn)，蛋白-DNA復合物在冷競爭實驗時消失，而進行突變競爭實驗時，該復合物再次出現(xiàn)；
　　4.Real time PCR示ORF3-GFP明顯抑制了TNF-α誘導的NF-κB的下游基因IL-1β、COX2和ICAM1的mRNA表達水平;ELISA證實NF-κB的下游分子IL-1β、C

13、OX2、和ICAM1的蛋白水平也同樣受到了抑制；
　　5.Western blot顯示，空白細胞組和轉(zhuǎn)染空載體的細胞組給予TNF-α刺激后，IKKβ活性和IKBα的磷酸化水平明顯增強，而轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細胞給予TNF-α刺激后，IKKβ活性和IKBα的磷酸化水平明顯受到抑制；
　　6.PCR Array實驗表明，轉(zhuǎn)染ORF3-GFP蛋白的細胞A20基因水平明顯高于對照組10倍以上，real time PCR和wes

14、tern blot也證實了同樣的結(jié)果；
　　7.將A20基因進行RNAi后，ORF3-GFP蛋白抑制NF-κB活性的現(xiàn)象得到了逆轉(zhuǎn)；表達ORF3-GFP蛋白的細胞組A20的升高與GRP78呈正相關(guān)性，將非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）抑制后，ORF3-GFP抑制TNF-a誘導的NF-κB活性的現(xiàn)象也得到了逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論
　　1.基因I型HEV ORF3蛋白抑制TNF-α誘導

15、的NF-κB活性及其下游分子，提示這可能是基因I型HEV在體內(nèi)持續(xù)存在并引起較高病毒血癥和更長病程的原因；
　　2.基因I型HEV ORF3蛋白在早期可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR激活NF-κB信號，隨后，NF-κB下游的靶基因A20在NF-κB信號中發(fā)揮負性調(diào)控作用，及時終止NF-κB信號的無限放大。這提示，ORF3蛋白在不同的階段對NF-κB信號的調(diào)控可能存在雙向調(diào)節(jié)作用。
　　3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NF-κB信號之間有著密切聯(lián)系