戊型肝炎病毒ORF3蛋白與豬肝組織相互作用蛋白的篩選及驗證.pdf

1、戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）引起的病毒性肝炎。HEV為無包膜、單鏈、正義 RNA病毒，其基因組全長約7.2kb,包含三個閱讀框，即 ORF1-ORF3。明確感染人的HEV可分為1-4基因型，其中3和4型既感染人也感染動物，為人畜共患性的，豬是其主要動物宿主。研究顯示，ORF3蛋白是一個多功能蛋白，參與多種機制，但 ORF3的功能至今還不明確。為了探索 HEV感染、

2、致病及不同宿主差異的機制，我們采用酵母雙雜交的方法篩選了與4型 ORF3相互作用的豬宿主蛋白，對這些蛋白的相互作用進行驗證，并采用生物信息學軟件和技術(shù)對ORF3蛋白的功能及其對宿主細胞生物過程產(chǎn)生的影響進行了分析和推測，同時也比較了人和豬宿主差異的機制。我們完成了如下工作：
　　1、首先對本實驗室構(gòu)建的pGBKT7-W3-ORF3誘餌質(zhì)粒進行了鑒定，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Y2H gold酵母菌中，進行誘餌蛋白毒性、自激活檢測，并應用We

3、stern Blot檢測 ORF3蛋白在酵母菌株 Y2Hgold中的表達情況，確認 ORF3蛋白沒有毒性、沒有自激活性及在 Y2Hgold中正確表達。
　　2、采用大規(guī)模酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)，將豬肝 cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞 Y2H/pGBKT7-W3-ORF3,進行豬肝 cDNA文庫篩選，共進行了三次文庫篩選，篩選了1.09×107個cDNA文庫克隆，獲得了257個陽性克隆。
　　3、257個陽性克隆經(jīng)酵母質(zhì)粒提取，大腸桿

4、菌質(zhì)粒擴增，質(zhì)粒測序、自激活及與 ORF3共轉(zhuǎn)再確認，最終得到54個真陽性克隆。這54個克隆中，有50個是已知蛋白，4個是未知蛋白。
　　4、將篩出的54個蛋白中的51個蛋白核酸序列分別構(gòu)建至 pProlabel載體，與pAcGFP-W3-ORF3共轉(zhuǎn)293FT細胞，采用Chemiluminescent Co-IP方法對蛋白相互作用進行驗證，最終我們獲得38個相互作用蛋白。對這些蛋白進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白分布在細胞的多個

5、部位，參與細胞代謝、細胞免疫、刺激反應、轉(zhuǎn)運等多個生物過程。推測 ORF3可能通過這些蛋白發(fā)揮多重作用。通過對蛋白功能富集聚類分析，發(fā)現(xiàn)有顯著多數(shù)量的蛋白分別參與甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、血小板激活和脫顆粒、補體和凝血級聯(lián)、不飽和脂肪的合成、血液凝固、高爾基體相關運輸?shù)纳锖铣傻壬镞^程。ORF3可能通過與目標宿主蛋白相互作用，參與這些相應的生物過程。
　　5、采用經(jīng)典的Co-IP方法對ORF3與 PLG、SERPINF2的相互作用