戊型肝炎病毒ORF3蛋白與豬肝組織相互作用蛋白的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）引起的病毒性肝炎。HEV為無(wú)包膜、單鏈、正義 RNA病毒，其基因組全長(zhǎng)約7.2kb,包含三個(gè)閱讀框，即 ORF1-ORF3。明確感染人的HEV可分為1-4基因型，其中3和4型既感染人也感染動(dòng)物，為人畜共患性的，豬是其主要?jiǎng)游锼拗?。研究顯示，ORF3蛋白是一個(gè)多功能蛋白，參與多種機(jī)制，但 ORF3的功能至今還不明確。為了探索 HEV感染、

2、致病及不同宿主差異的機(jī)制，我們采用酵母雙雜交的方法篩選了與4型 ORF3相互作用的豬宿主蛋白，對(duì)這些蛋白的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，并采用生物信息學(xué)軟件和技術(shù)對(duì)ORF3蛋白的功能及其對(duì)宿主細(xì)胞生物過(guò)程產(chǎn)生的影響進(jìn)行了分析和推測(cè)，同時(shí)也比較了人和豬宿主差異的機(jī)制。我們完成了如下工作：
　　1、首先對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pGBKT7-W3-ORF3誘餌質(zhì)粒進(jìn)行了鑒定，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Y2H gold酵母菌中，進(jìn)行誘餌蛋白毒性、自激活檢測(cè)，并應(yīng)用We

3、stern Blot檢測(cè) ORF3蛋白在酵母菌株 Y2Hgold中的表達(dá)情況，確認(rèn) ORF3蛋白沒(méi)有毒性、沒(méi)有自激活性及在 Y2Hgold中正確表達(dá)。
　　2、采用大規(guī)模酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)，將豬肝 cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 Y2H/pGBKT7-W3-ORF3,進(jìn)行豬肝 cDNA文庫(kù)篩選，共進(jìn)行了三次文庫(kù)篩選，篩選了1.09×107個(gè)cDNA文庫(kù)克隆，獲得了257個(gè)陽(yáng)性克隆。
　　3、257個(gè)陽(yáng)性克隆經(jīng)酵母質(zhì)粒提取，大腸桿

4、菌質(zhì)粒擴(kuò)增，質(zhì)粒測(cè)序、自激活及與 ORF3共轉(zhuǎn)再確認(rèn)，最終得到54個(gè)真陽(yáng)性克隆。這54個(gè)克隆中，有50個(gè)是已知蛋白，4個(gè)是未知蛋白。
　　4、將篩出的54個(gè)蛋白中的51個(gè)蛋白核酸序列分別構(gòu)建至 pProlabel載體，與pAcGFP-W3-ORF3共轉(zhuǎn)293FT細(xì)胞，采用Chemiluminescent Co-IP方法對(duì)蛋白相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，最終我們獲得38個(gè)相互作用蛋白。對(duì)這些蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白分布在細(xì)胞的多個(gè)

5、部位，參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞免疫、刺激反應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)生物過(guò)程。推測(cè) ORF3可能通過(guò)這些蛋白發(fā)揮多重作用。通過(guò)對(duì)蛋白功能富集聚類分析，發(fā)現(xiàn)有顯著多數(shù)量的蛋白分別參與甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、血小板激活和脫顆粒、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、不飽和脂肪的合成、血液凝固、高爾基體相關(guān)運(yùn)輸?shù)纳锖铣傻壬镞^(guò)程。ORF3可能通過(guò)與目標(biāo)宿主蛋白相互作用，參與這些相應(yīng)的生物過(guò)程。
　　5、采用經(jīng)典的Co-IP方法對(duì)ORF3與 PLG、SERPINF2的相互作用