基因1型戊型肝炎病毒ORF3抑制TLR3介導(dǎo)的NF-κB信號進行免疫逃逸的研究.pdf

1、近年來，關(guān)于戊型肝炎（HE）的報道越來越多。在發(fā)展中國家，戊型肝炎病毒(HEV)會通過糞-口途徑引起水源性的大規(guī)模爆發(fā)以及一些急性自發(fā)性的散發(fā)病例。戊型肝炎病毒是引起本地流行和自限性散發(fā)疾病的原因，當(dāng)然也會導(dǎo)致急性肝炎，少數(shù)的暴發(fā)性肝衰竭以及在中晚期孕婦人群中引起高達20％的致死率，這給我們的社會帶來了極大的危害。
　　HEV屬于肝炎病毒科，戊型肝炎病毒屬家族。該病毒為一大小約27-34nm的非包膜單股正鏈RNA病毒，其RNA長約

2、7.2kb，有三個開放讀碼框（ORFs），ORF1編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)聚合蛋白；ORF2編碼與病毒組裝和免疫原性有關(guān)的衣殼蛋白；ORF3編碼一個多功能的磷酸蛋白，其與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)宿主的炎癥反應(yīng)和保護被病毒感染的細(xì)胞有關(guān)。ORF3在N端包含兩個疏水結(jié)構(gòu)域D1和D2,在C端包含兩個富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域P1和P2。HEV分為4個基因型，但只有一個血清型，基因1型和2型僅感染人類，3型和4型屬于人畜共患型。
　　基因1型在流

3、行地區(qū)通常引起大規(guī)模的流行。其在青年人中有很高的急性肝炎發(fā)病率、在孕期導(dǎo)致更高的發(fā)病率和死亡率以及一定比例的爆發(fā)性肝衰竭。
　　然而，由于缺乏有效的細(xì)胞模型，HEV的致病機制尚不清楚。有報道稱其機制并不是直接的病毒復(fù)制造成的，而是由細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)的。最近，戊肝有效的細(xì)胞培養(yǎng)體系在人肺癌細(xì)胞A549中成功建立，我們課題組前期實驗證實在A549細(xì)胞中1型HEV ORF3可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化，然而ORF3在其他信號途

4、徑中的確切功能尚不清楚。由于缺乏有效的體內(nèi)模型，此研究的目的是在細(xì)胞水平研究1型HEV ORF3在TLRs誘導(dǎo)的NF-κB信號途徑中的作用。
　　總所周知，天然免疫是免疫系統(tǒng)的第一道防線。宿主的天然免疫系統(tǒng)通過不同的模式識別受體來識別微生物的病原相關(guān)分子模式，其中 TLRs是第一個被發(fā)現(xiàn)的模式識別受體。來源于病毒的核酸招募數(shù)個TLRs，其中，雙鏈RNA病毒是被TLR3鑒別，單鏈RNA病毒是被TLR7和TLR8鑒別，而非甲基化的Cp

5、G DNA病毒則是由TLR9鑒別。這些 TLRs在未受刺激的細(xì)胞中定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，一旦活化，就定位到內(nèi)體，在這里經(jīng)過蛋白酶處理，然后在高爾基體遇到內(nèi)化的核酸配體。個體TLRs通過招募MyD88或者TRIF促發(fā)特異性的應(yīng)答，除了TLR3是用TRIF依賴的信號途徑外，其余的TLRs都是用MyD88依賴的信號途徑。同時RIG-I樣受體（RLRs），包括RIG-I，Mda5和LGP2，也是感知胞漿內(nèi)的病毒的。為了應(yīng)答病毒的遺傳物質(zhì)，宿主會誘導(dǎo)依

6、賴IRF3/7的IFN產(chǎn)生和NF-κB途徑誘導(dǎo)的炎癥因子和趨化因子來干擾病毒復(fù)制。
　　NF-κB是一個調(diào)節(jié)多個生理功能的轉(zhuǎn)錄因子，其功能包括免疫應(yīng)答，抗凋亡和炎癥反應(yīng)。在TLRs和RLRs信號途徑中，異源二聚體（P65/P50）是最常見的活化形式。在未受刺激的細(xì)胞中，P65/P50被NF-κB的抑制蛋白IκB蛋白隔絕在胞漿，誘導(dǎo)刺激后由IκB激酶（IKK）復(fù)合物磷酸化IκB，導(dǎo)致IκB蛋白K48泛素化隨后被蛋白酶降解。結(jié)果是P6

7、5被釋放轉(zhuǎn)運到胞核，進而促進炎癥靶基因的表達。在這個過程中， TRADD-RIP1復(fù)合物是ORF3發(fā)揮抑制作用的關(guān)鍵角色，其中TRADD作為聯(lián)絡(luò)者和RIP1作為實施者一起使信號傳遞。在受體系統(tǒng)中，泛素化是對靶蛋白的一種重要的生理修飾方式，用來調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。K48泛素化是用蛋白酶系統(tǒng)識別靶蛋白，將其降解；而K63泛素化是促進蛋白與蛋白的連接和信號傳導(dǎo)。
　　我們研究發(fā)現(xiàn)，1型HEV ORF3能夠抑制TLR3介導(dǎo)的NF-κB信號通路的

8、活化。我們將帶有綠色熒光蛋白（GFP）的ORF3在A549細(xì)胞中過表達，然后用與病毒核酸相關(guān)的不同的TLRs激動劑刺激細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot）和免疫熒光試驗（Immunofluorescence Assay）來觀察p65（NF-κB亞單位）在胞漿和胞核的分布情況來評價NF-κB的活化程度。通過shRNAs基因干擾手段發(fā)現(xiàn)ORF3抑制NF-κB信號通路的活化是通過TLR3介導(dǎo)的途徑而不是RIG-I介導(dǎo)的途徑。這

9、種抑制作用在ELISA和RT-PCR實驗中TNF-α，IL-8和 IL-1β( NF-κB靶基因)表達水平的變化得到了驗證。同時，我們通過雙熒光素酶報告試驗發(fā)現(xiàn)ORF3的P2區(qū)域是其發(fā)揮抑制作用的關(guān)鍵區(qū)域。進一步免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)，TRADD和RIP1與TLR3形成復(fù)合物， ORF3使TRADD的表達量減少，RIP1的K63泛素化減弱。此外，我們還印證了RIP1中間結(jié)構(gòu)域的賴氨酸377位點是ORF3發(fā)揮抑制作用的功能性位點。綜上所述，我