DNA修復(fù)蛋白Ku80在肺腺癌的表達(dá)及對(duì)順鉑加培美曲塞聯(lián)合化療的化療敏感性研究.pdf

1、本研究通過在基因以及蛋白水平上檢測(cè)ⅢA期肺腺癌患者組織中Ku80的表達(dá)情況，探索并確定肺腺癌中Ku80表達(dá)水平與患者臨床特征以及新輔助化療療效的相關(guān)性。體外實(shí)驗(yàn)中，分別用短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA，shRNA)和互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)來抑制和上調(diào)Ku80的表達(dá)，探索Ku80的表達(dá)情況對(duì)順鉑、培美曲塞聯(lián)合介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。本研究旨在探討Ku80是否能夠預(yù)測(cè)ⅢA期肺腺癌患者接受順

2、鉑、培美曲塞聯(lián)合化療的敏感性，從而為ⅢA期肺腺癌的治療提供新的思路。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 Ku80在肺腺癌組織的表達(dá)以及臨床意義
　　目的：
　　1.檢測(cè)Ku80在肺腺癌組織的表達(dá)情況
　　2.分析肺腺癌組織Ku80表達(dá)水平的高低與臨床病理特征以及新輔助化療療效的相關(guān)性
　　方法：
　　1.對(duì)2013年9月到2016年9月所有在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科就診的肺癌患

3、者進(jìn)行支氣管鏡檢查，病理學(xué)證實(shí)為肺腺癌且臨床分期為ⅢA期的110名患者入選本課題。沒有患者接受過化療、放療以及靶向治療。所有病人都接受相同的一線新輔助化療方案兩個(gè)周期（順鉑聯(lián)合培美曲塞），通過CT評(píng)估患者的療效。
　　2.所有腫瘤標(biāo)本均來自于支氣管鏡活檢，運(yùn)用免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-P CR)技術(shù)來檢測(cè)110位肺腺癌患者組織中Ku80mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)合患者臨床資料以及患者的化療療效，應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)

4、據(jù)分析，采用X2檢驗(yàn)探討Ku80表達(dá)水平的高低與患者臨床病理特征的關(guān)系以及Ku80表達(dá)情況對(duì)于患者化療敏感性的影響。
　　結(jié)果：
　　110位ⅢA期肺腺癌患者根據(jù)化療療效，38人判定為化療有效(34.5％)，72人判定為化療無效(65.5％)。38位化療有效患者的肺腺癌組織中Ku80mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于72位化療無效患者的肺癌組織(3.612±2.392，7.981±2.684;p＜0.05)?；熡行ЫM的肺腺癌組織

5、中Ku80免疫組化評(píng)分也顯著低于化療無效組（2.079±1.617，5.597±2.114;p＜0.05）?？ǚ綑z驗(yàn)顯示Ku80mRNA以及蛋白水平的表達(dá)與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及化療敏感性相關(guān)(p＜0.05)，而與患者的年齡、性別以及吸煙情況無明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1.同化療療效較好的患者相比，療效差的患者Ku80在肺癌組織中表達(dá)顯著增高。
　　2.腺癌患者的惡性臨床病理特征與Ku80在mRNA和蛋白水

6、平的表達(dá)情況密切相關(guān)。
　　第二部分 靶向抑制或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞Ku80的表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為以及對(duì)于順鉑聯(lián)合培美曲塞化療敏感性的影響
　　目的：
　　1.探索Ku80基因?qū)τ诜蜗侔〢549細(xì)胞系生物學(xué)功能的影響。
　　2.明確特異性沉默以及上調(diào)肺腺癌細(xì)胞Ku80的表達(dá)對(duì)于體外順鉑聯(lián)合培美曲塞化療敏感性的影響.
　　方法：
　　1.構(gòu)建靶向沉默Ku80 shRNA和過表達(dá)Ku80 cDNA慢病毒載體

7、，并轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞得到Ku80沉默A549細(xì)胞系以及Ku80過表達(dá)A549細(xì)胞系。運(yùn)用qRT-PCR以及Western blot方法檢測(cè)Ku80基因沉默及過表達(dá)效果。
　　2.CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的增殖能力，繪制細(xì)胞生長曲線。按梯度配置聯(lián)合化療藥物細(xì)胞培養(yǎng)基，應(yīng)用CCK-8檢測(cè)聯(lián)合化療藥物對(duì)于轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞活性的影響。運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定抑制或者上調(diào)Ku80的表達(dá)水平對(duì)于A54

8、9細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。流式細(xì)胞術(shù)探索轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞對(duì)于同一濃度聯(lián)合化療藥物所致凋亡比率的差異。
　　結(jié)果：
　　1.選擇3個(gè)最佳siRNA序列，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建包含相應(yīng)shRNA的相應(yīng)GV115慢病毒載體:shRNA86、shRNA87、shRNA89，同時(shí)根據(jù)scramble序列，構(gòu)建相應(yīng)慢病毒載體作為陰性對(duì)照。shRNA以及scramble序列轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，細(xì)胞狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)染率超過80

9、％。
　　2.由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司制備Ku80過表達(dá)cDNA介導(dǎo)的慢病毒載體以及其相應(yīng)的空病毒作為陰性對(duì)照。Ku80-cDNA及相應(yīng)對(duì)照病毒載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，細(xì)胞狀態(tài)較好，轉(zhuǎn)染率大于80％。
　　3.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明:正常A549細(xì)胞Ku80 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1，感染shRNA-scramble、shRNA86、shRNA87以及shRNA89的A549細(xì)胞Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.0

10、83±0.15、0.534±0.17、0.663±0.13以及0.916±0.11。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549細(xì)胞Ku80 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.051±0.112、2.231±0.194。其中，在下調(diào)Ku80基因表達(dá)的shRNA序列中，shRNA86轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞的Ku80mRNA相對(duì)表達(dá)量最低，相對(duì)于其陰性對(duì)照組差異顯著(p＜0.05)。Ku80-cDNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞Ku80 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于

11、其陰性對(duì)照組及正常未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，說明Ku80-cDNA可以顯著增加A549細(xì)胞的Ku80 mRNA表達(dá)。
　　4.Western blot 檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率:正常A549細(xì)胞Ku80蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1，感染ShRNA-scramble、shRNA86、shRNA87以及shRNA89的A549細(xì)胞Ku80蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.892±0.15、0.033±0.029、0.072±0.009以及0.530±0.061

12、。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549細(xì)胞Ku80蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.083±0.182、2.102±0.574。抑制Ku80蛋白表達(dá)的shRNA序列當(dāng)中，shRNA86轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞的Ku80表達(dá)量最低，與其陰性對(duì)照組相比具有顯著差異(p＜0.05)。所以選擇shRNA86轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，Ku80-cDNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞Ku80蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于其陰性對(duì)照組及正常未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，說

13、明Ku80-cDNA可以顯著增加A549細(xì)胞的Ku80蛋白表達(dá)。
　　5.CCK8結(jié)果顯示抑制Ku80表達(dá)后，A549細(xì)胞的增殖能力與正常細(xì)胞相比明顯降低，而上調(diào)Ku80表達(dá)后A549細(xì)胞的增殖能力明顯提高。shRNA-scramble轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞以及空病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，增殖能力無明顯變化。
　　6.濃度梯度體外聯(lián)合化療測(cè)試結(jié)果顯示，同正常A549細(xì)胞相比，shNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞對(duì)于聯(lián)合化療藥物的化療敏

14、感性明顯增強(qiáng)，而Ku80-cDNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞對(duì)于該聯(lián)合化療藥物的敏感性顯著降低。shRNA-scramble轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞以及空病毒轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞較正常A549細(xì)胞對(duì)于聯(lián)合化療藥物的敏感性無明顯差異。
　　7.劃痕實(shí)驗(yàn)顯示shRNA轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞遷移能力明顯低于未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，而cDNA轉(zhuǎn)染后較轉(zhuǎn)染前A549細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)。相應(yīng)陰性對(duì)照組同未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞相比，遷移能力無明顯區(qū)別。

15、　　8.Transwell結(jié)果證實(shí)，shRNA感染后A549細(xì)胞的侵襲能力相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著降低，而cDNA轉(zhuǎn)染后侵襲能力明顯增強(qiáng)，二者相應(yīng)陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的侵襲能力無明顯差異。
　　9.流式細(xì)胞檢測(cè)表明，對(duì)于同一濃度的聯(lián)合化療藥物，shRNA轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞凋亡率明顯增加，而cDNA轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞凋亡率明顯下降。其相應(yīng)的兩個(gè)對(duì)照組與正常A549細(xì)胞的凋亡率無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.