DNA修復蛋白Ku80在肺腺癌的表達及對順鉑加培美曲塞聯(lián)合化療的化療敏感性研究.pdf

1、本研究通過在基因以及蛋白水平上檢測ⅢA期肺腺癌患者組織中Ku80的表達情況，探索并確定肺腺癌中Ku80表達水平與患者臨床特征以及新輔助化療療效的相關性。體外實驗中，分別用短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA，shRNA)和互補DNA(complementary DNA，cDNA)來抑制和上調Ku80的表達，探索Ku80的表達情況對順鉑、培美曲塞聯(lián)合介導的細胞凋亡的影響。本研究旨在探討Ku80是否能夠預測ⅢA期肺腺癌患者接受順

2、鉑、培美曲塞聯(lián)合化療的敏感性，從而為ⅢA期肺腺癌的治療提供新的思路。
　　本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 Ku80在肺腺癌組織的表達以及臨床意義
　　目的：
　　1.檢測Ku80在肺腺癌組織的表達情況
　　2.分析肺腺癌組織Ku80表達水平的高低與臨床病理特征以及新輔助化療療效的相關性
　　方法：
　　1.對2013年9月到2016年9月所有在山東大學附屬省立醫(yī)院胸外科就診的肺癌患

3、者進行支氣管鏡檢查，病理學證實為肺腺癌且臨床分期為ⅢA期的110名患者入選本課題。沒有患者接受過化療、放療以及靶向治療。所有病人都接受相同的一線新輔助化療方案兩個周期（順鉑聯(lián)合培美曲塞），通過CT評估患者的療效。
　　2.所有腫瘤標本均來自于支氣管鏡活檢，運用免疫組化和實時定量PCR(qRT-P CR)技術來檢測110位肺腺癌患者組織中Ku80mRNA和蛋白的表達水平。結合患者臨床資料以及患者的化療療效，應用SPSS19.0進行數(shù)

4、據(jù)分析，采用X2檢驗探討Ku80表達水平的高低與患者臨床病理特征的關系以及Ku80表達情況對于患者化療敏感性的影響。
　　結果：
　　110位ⅢA期肺腺癌患者根據(jù)化療療效，38人判定為化療有效(34.5％)，72人判定為化療無效(65.5％)。38位化療有效患者的肺腺癌組織中Ku80mRNA相對表達水平顯著低于72位化療無效患者的肺癌組織(3.612±2.392，7.981±2.684;p＜0.05)。化療有效組的肺腺癌組織

5、中Ku80免疫組化評分也顯著低于化療無效組（2.079±1.617，5.597±2.114;p＜0.05）?？ǚ綑z驗顯示Ku80mRNA以及蛋白水平的表達與患者的腫瘤大小、淋巴結轉移以及化療敏感性相關(p＜0.05)，而與患者的年齡、性別以及吸煙情況無明顯相關性。
　　結論：
　　1.同化療療效較好的患者相比，療效差的患者Ku80在肺癌組織中表達顯著增高。
　　2.腺癌患者的惡性臨床病理特征與Ku80在mRNA和蛋白水

6、平的表達情況密切相關。
　　第二部分 靶向抑制或上調肺腺癌細胞Ku80的表達水平對細胞生物學行為以及對于順鉑聯(lián)合培美曲塞化療敏感性的影響
　　目的：
　　1.探索Ku80基因對于肺腺癌A549細胞系生物學功能的影響。
　　2.明確特異性沉默以及上調肺腺癌細胞Ku80的表達對于體外順鉑聯(lián)合培美曲塞化療敏感性的影響.
　　方法：
　　1.構建靶向沉默Ku80 shRNA和過表達Ku80 cDNA慢病毒載體

7、，并轉染肺腺癌細胞得到Ku80沉默A549細胞系以及Ku80過表達A549細胞系。運用qRT-PCR以及Western blot方法檢測Ku80基因沉默及過表達效果。
　　2.CCK8檢測轉染與未轉染的A549細胞的增殖能力，繪制細胞生長曲線。按梯度配置聯(lián)合化療藥物細胞培養(yǎng)基，應用CCK-8檢測聯(lián)合化療藥物對于轉染及未轉染的A549細胞活性的影響。運用Transwell實驗和細胞劃痕實驗測定抑制或者上調Ku80的表達水平對于A54

8、9細胞遷移和侵襲能力的影響。流式細胞術探索轉染前后A549細胞對于同一濃度聯(lián)合化療藥物所致凋亡比率的差異。
　　結果：
　　1.選擇3個最佳siRNA序列，由上海吉凱基因化學技術有限公司構建包含相應shRNA的相應GV115慢病毒載體:shRNA86、shRNA87、shRNA89，同時根據(jù)scramble序列，構建相應慢病毒載體作為陰性對照。shRNA以及scramble序列轉染A549細胞后，細胞狀態(tài)良好，轉染率超過80

9、％。
　　2.由上海吉凱基因化學技術有限公司制備Ku80過表達cDNA介導的慢病毒載體以及其相應的空病毒作為陰性對照。Ku80-cDNA及相應對照病毒載體轉染A549細胞后，細胞狀態(tài)較好，轉染率大于80％。
　　3.qRT-PCR檢測結果表明:正常A549細胞Ku80 mRNA相對表達量為1，感染shRNA-scramble、shRNA86、shRNA87以及shRNA89的A549細胞Ku80 mRNA的相對表達量為1.0

10、83±0.15、0.534±0.17、0.663±0.13以及0.916±0.11。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549細胞Ku80 mRNA相對表達量為1.051±0.112、2.231±0.194。其中，在下調Ku80基因表達的shRNA序列中，shRNA86轉染后A549細胞的Ku80mRNA相對表達量最低，相對于其陰性對照組差異顯著(p＜0.05)。Ku80-cDNA轉染的A549細胞Ku80 mRNA的相對表達量明顯高于

11、其陰性對照組及正常未進行轉染的A549細胞，說明Ku80-cDNA可以顯著增加A549細胞的Ku80 mRNA表達。
　　4.Western blot 檢測慢病毒轉染效率:正常A549細胞Ku80蛋白的相對表達量為1，感染ShRNA-scramble、shRNA86、shRNA87以及shRNA89的A549細胞Ku80蛋白的相對表達量為0.892±0.15、0.033±0.029、0.072±0.009以及0.530±0.061

12、。感染空病毒以及Ku80-cDNA的A549細胞Ku80蛋白的相對表達量為1.083±0.182、2.102±0.574。抑制Ku80蛋白表達的shRNA序列當中，shRNA86轉染后A549細胞的Ku80表達量最低，與其陰性對照組相比具有顯著差異(p＜0.05)。所以選擇shRNA86轉染的A549細胞進行后續(xù)實驗。同時，Ku80-cDNA轉染的A549細胞Ku80蛋白的相對表達量明顯高于其陰性對照組及正常未進行轉染的A549細胞，說

13、明Ku80-cDNA可以顯著增加A549細胞的Ku80蛋白表達。
　　5.CCK8結果顯示抑制Ku80表達后，A549細胞的增殖能力與正常細胞相比明顯降低，而上調Ku80表達后A549細胞的增殖能力明顯提高。shRNA-scramble轉染的A549細胞以及空病毒轉染的細胞與正常細胞相比，增殖能力無明顯變化。
　　6.濃度梯度體外聯(lián)合化療測試結果顯示，同正常A549細胞相比，shNA轉染的A549細胞對于聯(lián)合化療藥物的化療敏

14、感性明顯增強，而Ku80-cDNA轉染的A549細胞對于該聯(lián)合化療藥物的敏感性顯著降低。shRNA-scramble轉染后的A549細胞以及空病毒轉染后的A549細胞較正常A549細胞對于聯(lián)合化療藥物的敏感性無明顯差異。
　　7.劃痕實驗顯示shRNA轉染的A549細胞遷移能力明顯低于未轉染A549細胞，而cDNA轉染后較轉染前A549細胞的遷移運動能力明顯增強。相應陰性對照組同未轉染A549細胞相比，遷移能力無明顯區(qū)別。

15、　　8.Transwell結果證實，shRNA感染后A549細胞的侵襲能力相對于未轉染細胞顯著降低，而cDNA轉染后侵襲能力明顯增強，二者相應陰性對照組與未轉染的A549細胞的侵襲能力無明顯差異。
　　9.流式細胞檢測表明，對于同一濃度的聯(lián)合化療藥物，shRNA轉染后的A549細胞凋亡率明顯增加，而cDNA轉染后的A549細胞凋亡率明顯下降。其相應的兩個對照組與正常A549細胞的凋亡率無明顯差異。
　　結論：
　　1.