腹腔注射地米那嗪對大鼠局灶性腦缺血-再灌注早期損傷的影響及機(jī)制.pdf

1、急性缺血性卒中后功能障礙給社會經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。及時開通閉塞的血管是有效的治療方法。然而即使經(jīng)過嚴(yán)格篩選，僅12～34％的患者可但復(fù)流腦組織的進(jìn)行性損傷卻是大量患者存在持續(xù)的神經(jīng)功能缺損。隨著早期再通治療的逐步推廣，根據(jù)疾病發(fā)展規(guī)律有針對性地尋找減輕再通治療后腦組織缺血/再灌注損傷的方法是進(jìn)一步降低缺血性卒中相關(guān)殘障的重要任務(wù)。
　　血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)普遍存在于機(jī)體組織，是介導(dǎo)氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎癥反

2、應(yīng)的重要物質(zhì)。AngⅡ高表達(dá)小鼠腦缺血/再灌注損傷程度更為嚴(yán)重;阻斷血管緊張素1型受體可減輕腦缺血/再灌注損傷。這些證據(jù)均表明血管緊張素系統(tǒng)可能在腦梗死病理生理過程中具有重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin converting enzyme2，ACE2)可將AngⅡ轉(zhuǎn)化為在功能上與之拮抗的血管緊張素1-7(Ang(1-7))，被認(rèn)為對缺血性卒中具有保護(hù)作用。地米那嗪(Diminazene aceturate

3、，DIZE)是一種潛在的ACE2激動劑。有研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮素誘導(dǎo)一過性局灶性腦缺血(transient focal ischemia)后對大鼠腹腔注射DIZE可顯著縮小腦梗死體積并改善神經(jīng)功能，但機(jī)制不詳。由于這種給藥途徑和給藥時間具有極高的臨床轉(zhuǎn)化價值，本研究目的在于利用更符合臨床大動脈急性閉塞再通的線栓模型驗(yàn)證腹腔注射DIZE對不同類型腦缺血/再灌注早期損傷的保護(hù)作用，并初步探索可能的機(jī)制，為進(jìn)一步明確其最佳適應(yīng)證奠定基礎(chǔ)。

4、　　第一部分大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型的建立與評價
　　目的:通過腔內(nèi)線栓法構(gòu)建大鼠局灶性缺血/再灌注損傷模型，探索缺血時間與再灌注腦損傷程度及主要方式的關(guān)系。
　　方法:
　　1、缺血時間與再灌注腦組織損傷程度的關(guān)系
　　將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組，分別建立大腦中動脈-過性閉塞1小時或2小時模型，于再灌注后24小時觀察神經(jīng)功能并取材檢測如下指標(biāo):
　　(1)建模成功大鼠24小時內(nèi)死亡率;
　　(2

5、)大鼠神經(jīng)功能損傷程度評分(NSS);
　　(3)通過TTC染色評價兩組梗死體積的差異;
　　(4)通過HE染色及Tunnel染色反映腦組織病理特征;
　　2、不同缺血時間下再灌注腦組織MDA水平變化趨勢
　　將24只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四組，同樣建立大腦中動脈短暫閉塞1小時或2小時模型，兩組分別于再灌注后6小時或24小時處死并取腦檢測缺血區(qū)域MDA含量;另設(shè)立空白組作為MDA基線水平。
　　結(jié)果:
　　

6、1、缺血時間與再灌注腦組織損傷程度的關(guān)系
　　(1)實(shí)際使用大鼠68只（7只造模失敗），缺血1小時組24小時內(nèi)無死亡，缺血2小時組中5只于24小時內(nèi)死亡，死亡率17.8％;
　　(2)缺血1小時組NSS評分顯著低于缺血2小時組(4.0[3.5，5.0] v.s.10.5[8.5，11.5]，p＜0.001);
　　(3) TTC顯示缺血1小時及2小時組梗死體積百分比分別為11.0±5.2，13.4+3.8，兩組間無統(tǒng)計

7、學(xué)意義;
　　(4)缺血2小時組Tunel陽性細(xì)胞比例高于缺血1小時組;
　　2、不同缺血時間下再灌注腦組織MDA水平變化趨勢
　　缺血1小時組24小時缺血區(qū)域皮層MDA水平顯著高于6小時;缺血2小時組24小時MDA水平較6小時降低。
　　結(jié)論:在本研究條件下，一過性缺血1小時/2小時模型中氧化應(yīng)激損傷發(fā)展速度存在顯著差異，缺血1小時再灌注后脂質(zhì)氧化程度高峰出現(xiàn)于再灌注第6小時后。
　　第二部分腹腔注射DI

8、ZE對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響
　　目的:采用不同缺血時間的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，評價腹腔注射DIZE對再灌注腦組織損傷的影響。
　　方法:
　　1、腹腔注射DIZE對缺血1小時再灌注損傷的影響
　　將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組:A、假手術(shù)（頸動脈分叉部分離）;B、缺血1小時+腹腔注射生理鹽水;C、缺血1小時+腹腔注射生理DIZE1.0mg/kg;D、缺血1小時+腹腔注射生理DIZE5.0mg/kg;

9、E、缺血1小時+腹腔注射生理DIZE15.0mg/kg。以術(shù)后24小時為研究終點(diǎn)，通過NSS評分評估五組神經(jīng)功能缺損情況;通過TTC染色評價后四組梗死范圍(％)(n=10)。進(jìn)一步以保護(hù)效應(yīng)最顯著的最低劑量作為實(shí)驗(yàn)劑量，以假手術(shù)組及生理鹽水為陰性對照及陽性對照;通過Tunel染色檢測缺血腦組織中不可逆損害細(xì)胞比例（n=6/組）;通過生化試劑盒檢測梗死周圍組織丙二醛(MDA)濃度反映氧化應(yīng)激水平（n=6/組）。
　　2、腹腔注射DI

10、ZE對缺血2小時再灌注損傷的影響
　　將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組:A、假手術(shù)（頸動脈分叉部分離）;B、缺血1小時+腹腔注射生理鹽水;C、缺血1小時+腹腔注射生理DIZE5.0mg/kg。以術(shù)后24小時為研究終點(diǎn)，通過NSS評分評估三組神經(jīng)功能缺損程度;通過TTC染色評價后兩組梗死范圍(％);通過檢測缺血腦組織MDA水平反映脂質(zhì)氧化程度。
　　3、腹腔注射DIZE對ACE2活性、AngⅡ及Ang(1-7)水平的影響

11、　　取空白組、缺血1小時再灌注第24小時大鼠血漿及腦組織，通過ELISA檢測腦組織及血漿ACE2活性、AngⅡ及Ang(1-7)水平(n=6)。
　　結(jié)果:
　　1、對于缺血1小時再灌注模型，腹腔注射DIZE5.0mg/kg組NSS評分及梗死范圍顯著低于生理鹽水對照組，劑量與保護(hù)效應(yīng)呈U形趨勢;腹腔注射DIZE5.0mg/kg組MDA水平顯著低于生理鹽水對照組;Tunel染色顯示腹腔注射DIZE組陽性細(xì)胞比例顯著低于生理鹽水

12、對照組，且伴隨caspase3水平下降;
　　2、對于缺血2小時再灌注模型，腹腔注射DIZE5.0mg/kg組NSS評分、梗死范圍及MDA水平均未見與生理鹽水對照組間存在顯著差別;
　　3、從血漿濃度差異來看，DIZE組血漿Ang(1-7)濃度顯著高于生理鹽水組（1.260±0.449，0.861±0.401ng/ml，p＜0.01），其余指標(biāo)在兩組間均無顯著差異;而腦組織中DIZE處理組及生理鹽水對照組間三指標(biāo)均未見顯著差

13、異。
　　結(jié)論:1、再灌注時腹腔注射DIZE5.0mg/kg可減輕大鼠缺血1小時再灌注后氧化應(yīng)激程度及細(xì)胞凋亡;2、腹腔注射DIZE可顯著上調(diào)24小時血漿Ang(1-7)水平。
　　第三部分 DIZE對神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注后細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:建立原代神經(jīng)元糖氧剝奪/再灌注（OGD/R）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，評價DIZE是否具有ACE2非依賴性保護(hù)作用。
　　方法:
　　1、獲取、分離、培養(yǎng)新生大鼠皮層

14、原代神經(jīng)元并進(jìn)行純化，通過尼氏染色鑒定神經(jīng)元比例;
　　2、DIZE對原代神經(jīng)元OGD/R損傷的影響。將神經(jīng)元分為5組，分別予以:①正常培養(yǎng);②OGD/R+正常培養(yǎng);③OGD/R+DIZE0.1μM;④OGD/R+DIZE1.0μM;⑤OGD/R+DIZE10.0μM，于24小時后通過AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞學(xué)評估細(xì)胞凋亡程度;通過western blot檢測各組cl-caspase3水平;每項(xiàng)指標(biāo)設(shè)置3個平行重復(fù)。