α-硫辛酸對甲基汞致大鼠神經(jīng)毒性的防護(hù)作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:甲基汞（methylmercury，MeHg）作為一種環(huán)境蓄積性污染物，嚴(yán)重?fù)p害人類和動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。MeHg進(jìn)入機(jī)體后，能夠與巰基結(jié)合，穿過血腦屏障在大腦內(nèi)蓄積。MeHg能夠改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能，目前已有學(xué)者提出了幾種MeHg的神經(jīng)毒性機(jī)制，包括關(guān)于線粒體代謝的破壞、神經(jīng)遞質(zhì)代謝的干擾、氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的改變等。然而，目前對于MeHg的神經(jīng)毒性機(jī)制并未完全闡明，其引起的氧化損傷和興奮性毒性之間的關(guān)系

2、非常復(fù)雜，并不能用單一機(jī)制說明。
　　有研究表明MeHg的神經(jīng)毒性與ROS的過量生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。GSH作為機(jī)體的第一道防線，在抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用。GSH的合成受到Nrf2-ARE通路的調(diào)控，并受細(xì)胞內(nèi)Glu和半胱氨酸等的影響。Glu是一種興奮性氨基酸，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸的穩(wěn)定性及可塑性中發(fā)揮重要作用。Glu能通過重攝取及滅活受體而使突觸間隙中的Glu維持平衡。中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與Glu轉(zhuǎn)運(yùn)的包括XAG-系統(tǒng)和X

3、C-系統(tǒng)。XAG-系統(tǒng)能夠重攝取Glu，經(jīng)GS轉(zhuǎn)化為Gln。而XC-系統(tǒng)則是負(fù)責(zé)胱氨酸和Glu循環(huán)，以提供GSH合成的前體物質(zhì)。另外，當(dāng)突觸間隙內(nèi)Glu過多時，會過度激活NMDA受體，引起Ca2+的大量內(nèi)流，繼而加劇氧化損傷甚至激活凋亡的發(fā)生。有文獻(xiàn)提示MeHg產(chǎn)生的過量的ROS可能影響細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的應(yīng)答及干擾Glu重攝取和代謝，但其機(jī)制尚不明確。
　　α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，α-LA)是一種在酵母和菠

4、菜中發(fā)現(xiàn)的生物因子，具有水溶性和脂溶性，能夠有效清除體內(nèi)的ROS，屬于強(qiáng)效抗氧化劑。已有研究表明，α-LA對心、腦、腎的缺血再灌注損傷、糖尿病及其神經(jīng)并發(fā)癥、中樞神經(jīng)退行性疾病中具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。但是，應(yīng)用α-LA預(yù)處理來拮抗MeHg的神經(jīng)毒性未見報道。
　　本研究通過整體動物實驗與體外細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方法。建立MeHg短期重復(fù)暴露動物模型，研究MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)氧化損傷和Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的相互作用及α-LA的保護(hù)作用;建

5、立神經(jīng)元的MeHg染毒模型，研究α-LA對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧化損傷和鈣超載的保護(hù)作用;建立星形膠質(zhì)細(xì)胞的MeHg染毒模型，研究α-LA對MeHg致大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷及谷氨酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的保護(hù)作用。以此來深入探討MeHg所致氧化損傷與Glu代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙介導(dǎo)的興奮性毒性的相互相互作用，為MeHg中毒的防治提供實驗依據(jù)。
　　研究方法:1、大鼠整體實驗研究:健康SPF級Wistar大鼠72只，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗

6、動物中心提供。體重170±10克，雌雄各半。按體重隨機(jī)分為4組，每組18只。分別為對照組，4、12μmol/kg MeHg組和35μmol/kgα-LA預(yù)處理組。對照組，4、12μmol/kg MeHg組的大鼠皮下注射生理鹽水，35μmol/kgα-LA預(yù)處理組大鼠皮下注射35μmol/kgα-LA。2h后，對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，4、12μmol/kgMeHg組和35μmol/kgα-LA預(yù)處理組大鼠分別腹腔注射4、12和12μm

7、ol/kg MeHgCl，注射容量為5 ml/kg。α-LA預(yù)處理隔日1次，染毒每周5次，連續(xù)預(yù)處理與染毒4周。最后一次染毒24 h后，每組選取6只大鼠麻醉，處死，切取枕葉大腦皮質(zhì)100mg測定汞含量。其余大腦皮質(zhì)根據(jù)檢測指標(biāo)的不同，制備成不同濃度的勻漿液，測定大腦皮質(zhì)丙二醛、蛋白巰基、蛋白羰基、GSH、Cys、Glu和Gln的含量，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶、SOD、GSH-Px、GS、PAG以及γ-GCS、γ-GT、

8、GST的活力。各組再取4只大鼠制備單細(xì)胞懸液，用于測定大腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量、游離Ca+濃度及細(xì)胞凋亡壞死率。每組選取4只大鼠提取總RNA及蛋白，用于檢測Nrf2及其下游基因和蛋白(HO-1、GCLC、GCLM、EAAT3、GPx-1、xCT)、NMDA受體(NR1、NR2A、NR2B)、Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLAST和GLT-1）自噬(Atg-5、Beclin-1、LC3)和凋亡(Caspase3、Bax、Bcl-2)的mRNA和蛋白表達(dá)

9、水平。各組其余4只大鼠，麻醉后以4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液左心室灌流固定后，免疫組化反應(yīng)檢測8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量，進(jìn)行HE染色及透射電鏡觀察其病理學(xué)改變。
　　2、體外神經(jīng)元培養(yǎng):神經(jīng)元經(jīng)NSE免疫熒光鑒定陽性率90％以上可進(jìn)行實驗。通過對于MeHg（0～2μmol/L）處理0.5～12 h后、α-LA（12.5～100μmol/L）預(yù)處理0.5～6 h后的細(xì)胞活力及LDH漏出的分析，選擇以1μmol/L MeHg處

10、理6h，12.5、25、50μmol/Lα-LA預(yù)處理3h構(gòu)建神經(jīng)元模型，觀察各組的神經(jīng)元形態(tài)，并測定細(xì)胞凋亡率，ROS水平，Ca2+-ATPase活力，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量，鈣蛋白酶活力及NMDA受體(NR1、NR2A和NR2B)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　3、體外星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng):星形膠質(zhì)細(xì)胞在傳代純化后，經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定陽性率90％以上可進(jìn)行實驗。通過對于MeHg(0～20μmol/L)處理6～30 h后、α-L

11、A（12.5～100μmol/L）預(yù)處理1～12h后的細(xì)胞活力及LDH漏出的分析，選擇以10μmol/L MeHg處理24 h，12.5、25、50μmol/Lα-LA預(yù)處理6h構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，觀察各組的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。并測定細(xì)胞凋亡率，ROS水平，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量，NPSH含量，Nrf2及其下游基因蛋白HO-1、GCLC、xCT的mRNA和蛋白表達(dá)水平，GLAST、GLT-1和GS的mRNA和蛋白表達(dá)水平及Na+-K+-

12、ATPase和GS的活力。
　　結(jié)果:1、大鼠整體實驗研究:與對照組相比，4μmol/kg MeHg組和12μmol/kgMeHg組大腦皮質(zhì)汞含量均顯著升高。染MeHg組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，MDA、蛋白羰基及8-OHdG含量逐漸升高;蛋白巰基、GSH含量，ATPase及SOD和GSH-Px活力逐漸降低;細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1、GCLC、GCLM、EAAT3、Gpx-1和xCT的mRNA表達(dá)水平逐漸升高，Nrf2、HO-1和GCL

13、M的蛋白表達(dá)水平也逐漸升高，而GCLC、EAAT3、Gpx-1和xCT的蛋白表達(dá)水平卻逐漸降低;Glu含量、PAG活力顯著升高;Gln、Cys含量，γ-GT、γ-GCS、GST和GS活力均顯著降低;細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量和細(xì)胞凋亡水平逐漸升高;NMDA受體及GLAST和GLT-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸下降，自噬與凋亡基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，大腦皮質(zhì)組織形態(tài)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度逐漸加重。而35μmol/kgα-LA預(yù)處

14、理組與12μmol/kg MeHg組相比，雖然大腦皮質(zhì)內(nèi)Hg含量未見顯著性降低，但大腦皮質(zhì)的氧化損傷和谷氨酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)障礙均有不同程度的緩解。
　　2、體外神經(jīng)元培養(yǎng):通過對于原代培養(yǎng)的神經(jīng)元用MeHg（0～2μmol/L）處理0.5～12 h后、α-LA（12.5～100μmol/L）預(yù)處理0.5～6 h后的細(xì)胞活力及LDH漏出的分析，選擇以1μmol/L MeHg處理6h，12.5、25、50μmol/Lα-LA預(yù)處理3h構(gòu)建神

15、經(jīng)元模型。與對照組相比，1μmol/L MeHg組神經(jīng)元出現(xiàn)嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)損傷，細(xì)胞凋亡率、ROS、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量及Calpain活力顯著升高;Ca2+-ATPase活力顯著降低;NR1、NR2A和NR2B的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，NR1和NR2A蛋白表達(dá)水平顯著升高，NR2B的蛋白表達(dá)水平未見統(tǒng)計學(xué)差異。而與1μmol/LMeHg組相比，隨著α-LA預(yù)處理劑量的增加，能減輕神經(jīng)元的損傷，并具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　

16、3、體外星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng):通過對體外培養(yǎng)的純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞用MeHg(0～20μmol/L)處理6～30 h后、α-LA(12.5～100μmol/L)預(yù)處理1～12h后的細(xì)胞活力及LDH漏出的分析，選擇以10μmol/L MeHg處理24 h，12.5、25、50μmol/Lα-LA預(yù)處理6h構(gòu)建星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，與對照組相比，10μmol/L MeHg組星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)損傷，細(xì)胞凋亡率、ROS及細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量

17、顯著升高;NPSH含量、Na+-K+-ATPase及GS活力顯著降低;Nrf2及其下游基因蛋白HO-1、GCLC、xCT的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高;GLAST、GLT-1和GS的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。而與10μmol/L MeHg組相比，隨著α-LA預(yù)處理劑量的增加，能減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，并具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論:1、MeHg可導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)ROS生成增加，抑制XC-系統(tǒng)使GSH合成障礙加劇氧