PRMT2及其剪接體對雌激素受體β轉(zhuǎn)錄活性的影響.pdf

1、目的:比較在不同條件下,PRMT2及其新的剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ對ERβ轉(zhuǎn)錄活性的影響;檢測PRMT2及PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ與ERβ在細(xì)胞外的相互作用。
　　方法:將pcDNA3.0-PRMT2、pcDNA3.0-PRMT2α、pcDNA3.0-PRMT2β、pcDNA3.0-PRMT2γ及pcDNA3.0空載體質(zhì)粒,分別與pcDNA3.0-ERβ瞬時共轉(zhuǎn)染(采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法)293T細(xì)

2、胞,建立螢火蟲熒光素酶雙報(bào)告基因檢測系統(tǒng),選用含受雌激素反應(yīng)元件(ERE,estrogen response elements)一致序列調(diào)控的熒光素酶基因(ERE-Luc)作為報(bào)告基因,通過熒光測定儀檢測ERE-luc熒光素酶基因活性值,進(jìn)而觀察PRMT2及其剪接體對ERβ轉(zhuǎn)錄活性的影響。該部分包括兩個內(nèi)容,其一觀察在有無雌激素以及不同濃度雌激素的條件下,PRMT2及PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ質(zhì)粒分別對ERβ轉(zhuǎn)錄活性的影響

3、;其二是觀察在選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑〔ICI182,780(氟維司群)、4-OHT(4-羥基他莫西芬)〕條件下,PRMT2及其各剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ對ERβ轉(zhuǎn)錄活性的影響。將表達(dá)融合蛋白GST-PRMT2及其剪接體的重組質(zhì)粒和表達(dá)GST的空載體pGEX-5T轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá),將獲得的蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色法驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平。GST-Sepharose4B親和

4、層析法純化GST-PRMT2α、GST-PRMT2β、GST-PRMT2γ融合蛋白及GST蛋白,將pcDNA3.0-ERβ瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解液,運(yùn)用GST pull-down技術(shù)檢測PRMT2及其各剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ與ERβ在細(xì)胞外相互作用情況,及其與雌激素的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1、通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),在雌激素不存在時,PRMT2及其剪接體對ERβ轉(zhuǎn)錄活性

5、無明顯提高;在雌激素存在時,與空載體相比,PRMT2及其剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ分別使ERβ的轉(zhuǎn)錄活性提高了約2.09倍,1.65倍,1.77倍及1.98倍;隨著雌激素濃度的提高,PRMT2及其剪接體對ERβ轉(zhuǎn)錄活性在10nm處達(dá)到高峰,到1000nm其活性被明顯抑制;
　　2、分別加入選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(ICI182,780,4-OHT),選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑可降低PRMT2及其剪接體PRMT2α、P

6、RMT2β、PRMT2γ對ERβ轉(zhuǎn)錄活性。
　　3、通過GST pull-down技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),無論雌激素是否存在,GST蛋白與ERβ不能結(jié)合,而GST-PRMT2α、GST-PRMT2β、GST-PRMT2γ融合蛋白均能分別與ERβ結(jié)合,在雌激素存在條件下,結(jié)合作用無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1、PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ與PRMT2一樣,在適當(dāng)濃度雌激素的條件下,能以雌激素依賴的形式提高ERβ轉(zhuǎn)錄活