家蠶BmYki不同剪接體的功能研究.pdf

1、Hippo Pathway是一類重要的調(diào)節(jié)器官生長的信號通路。在Hippo信號通路中，其核心就是由一系列的磷酸化的成分組成：絲氨酸/蘇氨酸Ste20家族激酶Hpo;核Dbf-2相關（NDR）家族激酶Warts(Wts),以及兩種相互作用的支架蛋白Sav和作為腫瘤抑制基因(Mats)的Mob。當其中任何一個成員發(fā)生突變時，都會造成細胞的生長異常。例如：在成蟲的發(fā)育過程中，Wts的突變在多個器官和組織的發(fā)育過程中能夠引起劇烈的細胞增殖。Yo

2、rkie，作為存在于在Hippo Pathway信號通路中最核心的含有WW結構域的轉錄共激活因子，是該信號通路中一個激酶級聯(lián)反應最重要的下游元件，即Hop-Sav復合物磷酸化并激活Wts-Mats復合物的下游元件。激活后的Wts-Mats復合物導致轉錄輔助激活因子Yorkie(Yki)發(fā)生磷酸化與細胞質(zhì)中的14-3-3蛋白結合，從而失活并滯留在細胞質(zhì)中。當Hippo Pathway信號通路發(fā)生抑制時，Yki的抑制作用就會消失，進入細胞核

3、中，與轉錄因子Sd結合,通過調(diào)節(jié)Hippo Pathway的目的基因包括diap1，cyclinE和Bantam來引起細胞的增殖以及抑制細胞凋亡等過程。
　　1.家蠶Yki基因不同剪接體及突變體轉化細胞的篩選與鑒定
　　為了研究家蠶Hippo信號通路中的關鍵輔助轉錄因子BmYki不同剪接體的功能，需要獲得穩(wěn)定的轉基因細胞系。通過獲得重組質(zhì)粒pIZT-V5/His-BmYki2和pIZT-V5/His-BmYki3，將獲得的重

4、組質(zhì)粒和錢瑩先前構建好的pIZT-V5/His-BmYki1和pIZT-V5/His-BmYki1S97A以及本實驗室保存好的空載pIZT-V5/His載體轉染進家蠶BmN細胞中。細胞定位結果顯示：BmYki1，BmYki2，BmYki3及和BmYki1S97A蛋白在家蠶BmN培養(yǎng)細胞中能夠表達，且BmYki1主要分布在細胞質(zhì)中，BmYki2主要分布于細胞核中，BmYki3主要分布于細胞核中，磷酸化位點突變后的BmYki1S97A在細胞

5、核中也能檢測到，表明BmYki1磷酸化對于該蛋白的表達位置起著重要作用，空白對照組顯示Yki基因主要分布于細胞質(zhì)中。從而進一步說明在Hippo信號通路中，BmYki2和BmYki3對細胞的生長起著正調(diào)控的作用。
　　2.過表達BmYki1，BmYki2，BmYki3及BmYki1S97A對細胞及家蠶翅原基的影響
　　為了探討B(tài)mYki基因不同剪接亞型的功能，本章研究主要在兩方面進行：細胞和翅原基。
　　當不同剪接亞型基

6、因在細胞上過表達時，細胞遷移、細胞增殖、細胞大小和細胞周期均發(fā)生了不同的變化。結果顯示：在0 h-78 h，過表達BmYki1，BmYki2，BmYki3，BmYki1S97A及pIZT-V5/His載體的BmN細胞及野生型細胞分別遷移了1294.96μm，1097.62μm，1327.60μm，1098.87μm，633.59μm，1027.00μm，而其中過表達BmYki3的細胞相比較野生型細胞及其他轉基因細胞而言在相同的時間內(nèi)遷移

7、距離最大。pIZT-V5/His-BmYki1-BmN細胞和pIZT-V5/His-BmYki3-BmN細胞分裂速度高于野生型BmN細胞；pIZT-V5/His-BmYki2-BmN細胞，pIZT-V5/His-BmYki1S97A-BmN細胞和pIZT-V5/His-BmN細胞分裂速度低于野生型BmN細胞。其中p IZT-V5/His-BmYki3-BmN細胞分裂速度最高，pIZT-V5/His-BmYki1S97A-BmN細胞分裂速

8、度最慢。細胞大小隨著時間的增長在逐步增加，BmN細胞，pIZT-V5/His-Bm Yki1-BmN細胞，pIZT-V5/His-BmYki2-BmN細胞，pIZT-V5/His-BmYki3-BmN細胞分別在第3天，第3、5天，第3、6天，第2、5天時，細胞又突然變小，可能由于細胞開始新一輪的增殖分化。在細胞周期方面，pIZT-V5/His-BmYki1-BmN細胞、pIZT-V5/His-BmYki2-BmN細胞、pIZT-V5/H

9、is-BmYki3-BmN細胞的S期/G2期普遍比對照組細胞高，而突變體轉基因細胞的S期/G2期和對照組細胞相近。過表達B mYki1基因后，kibra、iap、fj和ex基因的表達量較pIZT-BmN細胞有顯著增加；過表達BmYki2基因后，wnt、kibra、iap、fj、ex和bmpr基因較pIZT-BmN細胞有顯著增加；過表達BmYki3基因后，wnt、kibra、iap、fj、ex和bmpr基因均有顯著上調(diào)；過表達BmYki1

10、S97A基因后，wnt、kibra、fj、ex、crb和bmpr基因表達量較p IZT-BmN細胞有所提高。cat、dpp、serr和stat基因在pIZT-V5/His-BmN、轉Bm Yki1，BmYki2，BmYki3和BmYki1S97A的細胞系中的表達水平均下調(diào)。
　　在翅膀過表達后，過表達BmYki1基因，BmYki2基因和BmYki3基因時，蠶蛾右翅發(fā)育異常的比例分別有30％、40%和30%；而只注射ddH2O的對照

11、組的蠶蛾翅膀均正常發(fā)育。前翅擴大比率普遍比后翅擴大比率大。當翅膀過表達BmYki1時，myc、ex、kibra、wts2、iap、fj、bmpr、wnt和dpp基因均有所下降，cat、cycE和stat基因上調(diào)；當過表達BmYki2時，myc、ex、kibra、wts2、iap、fj、bmpr、wnt和dpp基因均有所下降，cat和cycE基因上調(diào)；當過表達BmYki3時，myc、ex、kibra、fj和dpp基因均有所下降，cat、c

12、ycE、crb和wts2基因上調(diào)。
　　3.過表達BmYki3家蠶細胞轉錄組的比較研究
　　為了更加全面了解過表達BmYki3后，家蠶BmN細胞內(nèi)部基因發(fā)生的變化，通過應用RNA-Seq技術獲得轉錄組信息。分析結果顯示：，在家蠶BmN細胞與過表達BmYki3細胞比較中，其中上調(diào)基因的數(shù)量有10291個，下調(diào)基因的數(shù)量有4444個。GO(Ontology)富集分析顯示：差異表達基因有49個GO分類，分別在細胞組件、分子功能和生

13、物進程三個大類中。KEGG富集分析顯示，與家蠶細胞增殖、分化、凋亡、大小相關的MAPK、Wnt、Hippo、JAK-STAT、mTOR等信號通路均有富集，且有基因富集多個信號通路中，將多條信號通路聯(lián)系在一起，共同發(fā)揮調(diào)控作用。
　　在家蠶Hippo信號通路中，剪接體BmYki1、BmYki2和BmYki3功能有所不同，其中BmYki1起次要的正調(diào)控作用，BmYki2起微調(diào)及平衡調(diào)節(jié)作用，BmYki3起著主要正調(diào)控作用。當過表達Bm

14、Yki1時，會促進BmYki3的表達，主要定位于細胞質(zhì)中，細胞增殖速度變快，細胞分裂數(shù)增加，細胞遷移速率變快，細胞體積增大；當過表達BmYki2時，并不會促進BmYki3的表達，反而使BmYki3的表達量有微弱下調(diào)，由于缺少一個WW結構域，主要定位在細胞核中，細胞質(zhì)中也存在，細胞的增殖速度沒有明顯變快，細胞分裂數(shù)沒有明顯增加，細胞遷移速率么有明顯加快；當過表達BmYki3時，會促進BmYki1的表達，但是BmYki3的表達量沒有明顯增加