PRMT2對AngⅡ 誘導VSMC增殖的調控作用及其機制研究.pdf

1、蛋白質精氨酸甲基轉移酶2（PRMT2）是蛋白質精氨酸甲基轉移酶家族成員之一，通過甲基化蛋白質氨基酸序列中的精氨酸殘基參與調控機體多種細胞過程。最近有研究發(fā)現(xiàn)PRMT2可能在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，PRMT2基因敲除小鼠與正常小鼠相比，在給予病理因素干擾后出現(xiàn)明顯的血管壁增厚、血管內膜增生、血管平滑肌細胞（VSMC）增殖現(xiàn)象。VSMC異常增殖是多種心血管疾病共同的病理特征，常伴隨心血管疾病發(fā)病進程出現(xiàn)。引起VSMC異常增殖的誘因眾多，血

2、管緊張素Ⅱ（AngⅡ）則是誘導VSMC異常增殖的主要生物活性因子之一，AngⅡ可通過誘導血管內炎癥反應發(fā)生引起血管結構炎性改變，促進VSMC轉型、增殖。大量文獻報道，PRMT2在各種炎癥模型中表達均有顯著變化，PRMT2抑制炎癥反應引起的細胞凋亡，影響炎癥反應經(jīng)典信號通路NF-κB激活。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制蛋白（IκB-α）可能是PRMT2作用底物之一，我們推測PRMT2可能通過作用于IκB-α影響NF-κB信號通路及VSMC增殖?；?/p>

3、于此，本課題將深入探討PRMT2在AngⅡ誘導VSMC增殖中的作用及其作用機制。
　　第一部分、AngⅡ對VSMC細胞內PRMT2表達的影響
　　目的：觀察AngⅡ對VSMC細胞內PRMT2表達的影響
　　實驗方法：用不同濃度（0、0.01、1、100nM）AngⅡ處理人主動脈血管平滑肌細胞不同時間（0、6、12、24h），MTT法檢測細胞增殖率、Western blot檢測PRMT2、增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白表

4、達量的變化，RT-PCR檢測PRMT2 mRNA的表達水平。
　　結果：血管平滑肌細胞增殖率、PCNA蛋白表達量隨AngⅡ處理濃度增加而增加，PRMT2 mRNA、蛋白表達水平隨AngⅡ處理濃度增加而降低（P<0.05）；血管平滑肌細胞增殖率、PCNA蛋白表達量隨AngⅡ處理時間增加而增加，PRMT2 mRNA、蛋白表達水平隨AngⅡ處理濃度、時間增加而降低（P<0.05）。
　　小結：AngⅡ濃度、時間依賴性下調VSMC中

5、PRMT2的mRNA、蛋白表達。
　　第二部分、PRMT2對AngⅡ誘導VSMC增殖的影響
　　目的：明確PRMT2在AngⅡ誘導VSMC增殖過程中的作用
　　實驗方法：構建PRMT2過表達載體，設立空載體（vector）組、AngⅡ處理組、AngⅡ+PRMT2組；利用siRNA技術沉默PRMT2基因，設立陰性對照（NC）組、AngⅡ處理組、siPRMT2組、AngⅡ+siPRMT2組，MTT、流式細胞術檢測各組細胞增

6、殖率和周期變化，Western blot法檢測PRMT2、PCNA表達量。
　　結果：與AngⅡ組相比，AngⅡ+PRMT2組G0/G1期比例增加（P<0.05），細胞增殖率降低、S期比例下降、PCNA表達量減少（P<0.05），過表達PRMT2可減弱AngⅡ誘導VSMC增殖的作用；siPRMT2組細胞增殖率、PCNA表達量及周期分布與NC組比較均無明顯變化，表明僅僅沉默PRMT2基因對VSMC增殖狀態(tài)無顯著影響；AngⅡ+siP

7、RMT2組與AngⅡ組相比，PRMT2表達量下降（P<0.05），細胞增殖率增加（P<0.05），PCNA表達量、周期分布也有所增加，但無統(tǒng)計學意義，表明沉默PRMT2基因在一定程度上進一步增強AngII誘導VSMC增強的作用。
　　小結：PRMT2抑制AngⅡ誘導的VSMC增殖。
　　第三部分、PRMT2影響VSMC增殖的機制
　　目的：探討PRMT2影響VSMC增殖的機制
　　實驗方法：免疫熒光法檢測vect

8、or組、AngⅡ處理組、AngⅡ+PRMT2組NF-κB亞基p65細胞核內外分布，Western blot檢測各組炎癥因子IL-1β、IL-6表達量以及IκB-α總蛋白量、磷酸化水平，免疫共沉淀法驗證PRMT2和IκB-α的相互作用，ELISA法檢測各組培養(yǎng)基中甲基化產(chǎn)物ADMA含量。
　　結果：與vector組比較，AngⅡ處理組細胞核內p65熒光信號強度明顯增強，IL-1β、IL-6表達量增加（P<0.05），而與AngⅡ組比

9、較，AngⅡ+PRMT2組核內p65熒光強度顯著減弱，IL-1β、IL-6表達量減少（P<0.05），表明PRMT2可有效阻礙p65向核內轉移，抑制NF-κB激活及炎癥因子表達；免疫共沉淀結果顯示PRMT2與IκB-α之間存在相互結合，PRMT2可能是通過作用于IκB-α影響了NF-κB從細胞質向核內轉移；與vector組比較，AngⅡ組IκB-α總蛋白量減少、磷酸化水平上調，ADMA含量減少（P<0.05），AngⅡ+PRMT2組與A

10、ngⅡ組相比，IκB-α總蛋白量增加、磷酸化水平下降，ADMA含量增加（P<0.05），PRMT2可能是通過甲基化IκB-α阻礙IκB-α磷酸化及降解，抑制NF-κB激活及炎癥反應發(fā)生，影響VSMC增殖。
　　小結：PRMT2可能通過甲基化IκB-α阻斷NF-κB信號通路、抑制AngⅡ誘導VSMC增殖
　　結論：
　　1. PRMT2可能在AngⅡ誘導VSMC增殖中起負調控作用。
　　2. PRMT2可能通過甲基