激活A(yù)MPK調(diào)控外周及中樞敏化治療慢性疼痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性疼痛是危害人類健康的嚴(yán)重問題。數(shù)據(jù)顯示，全球成人慢性疼痛的平均發(fā)病率約為30％，由于其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療非常困難。長期遭受慢性疼痛的患者，極易伴隨著焦慮、失眠、憂郁、抑郁等癥狀，不僅耗費(fèi)大量醫(yī)療資源，患者自身的生活質(zhì)量也嚴(yán)重下降。因此，如何有效的治療慢性疼痛已經(jīng)成為臨床急待解決的挑戰(zhàn)性問題。
　　慢性疼痛的類型主要有以下幾種，包括組織損傷（例如關(guān)節(jié)炎）后的炎性疼痛，癌癥疼痛和神經(jīng)損傷、脊髓損傷和腦損傷后的神經(jīng)性疼

2、痛（例如中風(fēng)和創(chuàng)傷）。慢性疼痛的特征通常在于痛覺過敏，其是對(duì)有害的熱和機(jī)械刺激以及異常性疼痛的增加的反應(yīng)，其中傷害性反應(yīng)發(fā)生于正常無害的刺激，例如輕微接觸（稱為機(jī)械性異常性疼痛）。神經(jīng)性疼痛的特征還在于灼燒疼痛，感覺異常（刺痛感，瘙癢）和感覺遲鈍（不愉快的，異常的觸覺）。
　　緩解慢性疼痛的常規(guī)藥物治療如非甾體類抗炎藥、阿片類藥物等并不能很好的控制疾病，而目前有一種新型的治療手段在臨床上使用很廣泛，且很多臨床報(bào)道證實(shí)其效果顯著，即

3、臭氧治療。臭氧在疼痛方面的應(yīng)用已經(jīng)有一百多年的歷史，1988年，意大利醫(yī)生Verga將臭氧注入腰大肌及椎旁間隙治療腰腿痛。1998年，Muto等報(bào)道將臭氧注入椎間盤及椎旁間隙治療腰椎間盤突出癥，有效率為78％。1994～2000年，Albertini報(bào)告6665例多中心治療腰椎間盤突出癥的研究結(jié)果，有效率為80.9％。亞洲和東歐某些地區(qū)，如羅馬、意大利、俄羅斯等都廣泛的將臭氧應(yīng)用于臨床。在中國，醫(yī)用臭氧作為一個(gè)非常重要的治療神經(jīng)病理性疼

4、痛的替代療法，被廣泛用于椎間盤突出癥、關(guān)節(jié)疾病、肩周炎、偏頭痛、周圍血管缺血性疾病及帶狀皰疹后遺疼痛等。雖然如今臭氧在疼痛類疾病的應(yīng)用中十分廣泛，但很少有學(xué)者研究臭氧治療疼痛的機(jī)理，而臭氧對(duì)疼痛有確切療效的實(shí)驗(yàn)學(xué)證據(jù)更是空白。這對(duì)臭氧的規(guī)范使用缺少了很多的指導(dǎo)證據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果與神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的前沿研究均提示:磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine mono-phosphate-activated protein

5、 kinase，AMPK)，在痛覺調(diào)制中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。AMPK是一個(gè)位于真核細(xì)胞中的絲氨酸-蘇氨酸激酶，是細(xì)胞中感受能量應(yīng)激并調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵分子。AMPK由催化性的α亞基和調(diào)控性的β，γ亞基組成，在不同的組織和細(xì)胞中組成多種異三聚體發(fā)揮蛋白質(zhì)激酶活性。是真核細(xì)胞中極為關(guān)鍵的能量平衡感受器和調(diào)控者。AMPK最經(jīng)典的激活通路是能量應(yīng)激使ATP迅速消耗導(dǎo)致的AMP/ATP比值增加。AMPK經(jīng)典的激動(dòng)劑包括白藜蘆醇、二甲雙胍等。白藜

6、蘆醇（芪三酚）作為一種天然多酚類物質(zhì)，是天然的抗氧化劑。白藜蘆醇不僅可抑制血小板凝結(jié)、降低血液的粘稠度、舒張血管，從而保持血液暢通，還可以預(yù)防癌癥的產(chǎn)生及發(fā)展。再者它還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病及治療缺血性心臟病和高血脂的作用。
　　最近的研究表明，AMPK不僅是一個(gè)能量響應(yīng)性酶，它也檢測(cè)氧化還原信號(hào)。臭氧具有強(qiáng)氧化性，所以臭氧起效的分子機(jī)制可能與AMPK密切相關(guān)。但是，臭氧是否是通過激活A(yù)MPK從而通過調(diào)節(jié)相關(guān)神經(jīng)炎癥來治療疼痛

7、，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們利用臭氧、白藜蘆醇通過不同的慢性疼痛模型，對(duì)AMPK在慢性疼痛中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　第一部分臭氧激活A(yù)MPK治療神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制研究
　　目的:研究臭氧對(duì)AMPK的作用，以及抑制神經(jīng)病理性疼痛的分子機(jī)制
　　方法:利用免疫印跡法檢測(cè)臭氧對(duì)AMPK的影響;測(cè)定經(jīng)典的疼痛行為學(xué)指標(biāo)——大鼠縮足反射閾值，考察臭氧對(duì)神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)的影響;利用免疫印跡法檢測(cè)臭氧對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛標(biāo)志性

8、分子指標(biāo)NR1、NR2B、PKCγ、 ERK的影響;利用免疫印記和免疫熒光法檢測(cè)臭氧對(duì)于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的影響。利用免疫印記和免疫熒光法檢測(cè)臭氧對(duì)于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中的AMPK和NF-κB的影響。
　　結(jié)果:臭氧可以減輕CCI導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)病理性疼痛所致的機(jī)械學(xué)超敏，能降低與中樞敏化密切相關(guān)的NR1、NR2B、PKCγ和ERK的磷酸化水平。同時(shí)，臭氧能夠在體內(nèi)外顯著激活A(yù)MPK。AMPK的激動(dòng)劑AICAR和A769662可

9、以很好的模擬臭氧的作用，減輕疼痛，同時(shí)臭氧的鎮(zhèn)痛作用能夠被AMPK抑制劑Compound C劑量依賴性的取消。在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中臭氧能夠抑制NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論:臭氧能夠通過激活A(yù)MPK，進(jìn)而抑制神經(jīng)病理性疼痛誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，使得其能夠治療神經(jīng)病理性疼痛。AMPK可能成為治療神經(jīng)病理性疼痛的潛在臨床靶點(diǎn)，促進(jìn)臭氧的臨床應(yīng)用。
　　第二部分白藜蘆醇激動(dòng)AMPK治療骨癌痛的機(jī)制研究
　　目的:研究白藜蘆

10、醇對(duì)骨癌痛的影響及其作用機(jī)制
　　方法:測(cè)定經(jīng)典的疼痛行為學(xué)指標(biāo)——大鼠縮足反射閡值，考察白藜蘆醇對(duì)骨癌痛行為學(xué)的影響;利用免疫印跡法檢測(cè)骨癌痛模型中AMPK的磷酸化水平，以及白藜蘆醇對(duì)其的影響;利用免疫熒光法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)于AMPK、脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度、MAPK家族的影響。利用免疫印跡法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)AKT、mTOR磷酸化水平的影響;利用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)AMPK及MAPK家族的

11、影響。
　　結(jié)果:白藜蘆醇可以減輕TCI導(dǎo)致的大鼠機(jī)械學(xué)超敏。白藜蘆醇可以顯著增加神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上的AMPK的磷酸化水平，能降低TCI引起的異常升高的MAPK家族、AKT和mTOR的磷酸化水平。同時(shí)，白藜蘆醇能夠抑制體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞上的MAPK家族的磷酸化水平，及神經(jīng)元上的AKT和mTOR的磷酸化水平。
　　結(jié)論:白藜蘆醇能通過激活A(yù)MPK抑制MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)