miR-34a-SIRT1信號(hào)通路參與慢性牙髓炎疼痛的中樞調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、慢性牙髓炎是指發(fā)生于牙髓組織的慢性炎癥性病變，主要表現(xiàn)為劇烈的疼痛，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。兒童除具有以上影響外，還可能因疼痛而導(dǎo)致偏側(cè)咀嚼，進(jìn)而影響頜骨發(fā)育及顏面部形態(tài)。當(dāng)牙髓發(fā)生炎癥或損傷時(shí)，延髓背角在細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)及突觸連接等方面發(fā)生變化，從而參與炎癥疼痛下延髓水平的中樞敏化過程，形成牙髓炎特征性的刺激痛等癥狀?，F(xiàn)在越來越多的實(shí)驗(yàn)表明：miRNA是一種新層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式，參與背根神經(jīng)節(jié)、脊髓背角等處疼痛狀態(tài)下

2、疼痛相關(guān)基因表達(dá)的改變。但迄今為止的，miRNA是否參與牙髓炎疼痛的中樞調(diào)控尚屬新的領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：開髓暴露法可產(chǎn)生理想的慢性牙髓炎痛敏模型；基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，慢性牙髓炎術(shù)后1天大鼠延髓背角多種miRNA分子變化顯著，其中miR-34a表達(dá)顯著降低；而文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-34a可調(diào)控多種疼痛相關(guān)基因的表達(dá)與活性。這為我們研究慢性牙髓炎疼痛的中樞調(diào)控機(jī)制提供了新思路：miR-34a可否作為一

3、種基因表達(dá)調(diào)控方式，參與慢性牙髓炎疼痛狀態(tài)下，延髓背角內(nèi)疼痛相關(guān)基因表達(dá)的改變?；谝陨霞僭O(shè)，我們?cè)O(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)，旨在探索慢性牙髓炎疼痛的中樞調(diào)控機(jī)制，從而為研發(fā)牙髓炎鎮(zhèn)痛藥物提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　目的：
　　本課題擬從miRNA分子參與慢性牙髓炎疼痛中樞調(diào)控入手，篩選出miR-34a及其下游靶基因SIRT1；通過檢測(cè)牙髓炎模型術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)延髓背角miR-34a、SIRT1的表達(dá)變化及細(xì)胞定位分析，探討miR-34a、S

4、IRT1與慢性牙髓炎疼痛之間的關(guān)系；通過慢病毒感染過表達(dá)miR-34a、鞘內(nèi)給予白藜蘆醇過表達(dá)SIRT1分子，探討miR-34a分子是否通過抑制下游靶基因SIRT1的表達(dá)水平，進(jìn)而參與慢性牙髓炎疼痛的中樞調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1．建立慢性牙髓炎痛敏模型：健康成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為牙髓炎組和對(duì)照組；牙髓炎組麻醉后于左側(cè)上頜第一磨牙，用1/2球鉆開髓并使之暴露于口腔，對(duì)照組麻醉后不作處理。于術(shù)前1d、術(shù)后1、3、7、1

5、4d檢測(cè)擦面行為總時(shí)間，評(píng)估大鼠疼痛反應(yīng)；不同時(shí)間點(diǎn)取延髓和牙髓，制作延髓冰凍切片及牙髓石蠟切片，用免疫熒光染色方法檢測(cè)延髓中c-Fos蛋白及牙髓中TNF-α的表達(dá)情況，HE染色觀察牙髓的炎癥情況。
　　2．基因芯片篩選出牙髓炎術(shù)后1d組與對(duì)照組之間的差異miR-34a分子；實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證；原位雜交和免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)定位miR-34a表達(dá)的細(xì)胞類型；通過軟件分析及文獻(xiàn)回顧，預(yù)測(cè)miR-34a可能作用的靶基因；實(shí)時(shí)定量PC

6、R和免疫熒光技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)一步驗(yàn)證；免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)定位SIRT1表達(dá)的細(xì)胞類型。
　　3．外科手術(shù)暴露大鼠延髓背角，體內(nèi)感染miR-34a慢病毒過表達(dá)載體，感染3w后建立慢性牙髓炎痛敏模型，術(shù)后1d檢測(cè)大鼠疼痛行為及同側(cè)延髓背角miR-34a、SIRT1的表達(dá)水平；小腦延髓池白藜蘆醇鞘內(nèi)置管連續(xù)給藥過表達(dá)SIRT1，牙髓炎術(shù)后1d檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠痛行為變化。
　　結(jié)果：
　　1．痛行為學(xué)結(jié)果顯示：牙髓炎疼痛具有時(shí)間相關(guān)性

7、，術(shù)后1d疼痛達(dá)到峰值，隨后疼痛程度逐漸降低；HE染色結(jié)果表明：牙髓炎術(shù)后1、3、7、14d，牙髓炎癥和壞死組織邊緣分別位于髓角、根頸1/3、根中1/3和根尖1/3處；牙髓TNF-α免疫熒光染色主要表達(dá)于鄰近壞死層的炎性牙髓組織內(nèi)，急性期（術(shù)后1d）表達(dá)最高；c-Fos免疫熒光染色結(jié)果顯示，術(shù)后2h延髓背角c-Fos陽性細(xì)胞顯著增多，提示延髓背角細(xì)胞活化。
　　2．基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠延髓背角多種miRNA分子變化顯著，其中mi

8、R-34a表達(dá)降低；qPCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，牙髓炎術(shù)后miR-34a表達(dá)顯著下調(diào)，除術(shù)后14d外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熒光原位雜交及免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：延髓背角有大量miR-34a雜交信號(hào)并與神經(jīng)元標(biāo)記物 NeuN共存，提示miR-34a主要表達(dá)于神經(jīng)元；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠同側(cè)延髓背角miR-34a顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過軟件預(yù)測(cè)及文獻(xiàn)回顧分析，我們選取Bcl-2、SIRT1、P5

9、3、HGF、Notch-1、USF-1和Met為可疑靶基因，通過qPCR進(jìn)一步篩選出SIRT1為miR-34a在慢性牙髓炎疼痛調(diào)控中的下游靶基因。qPCR及免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證顯示：牙髓炎術(shù)后SIRT1表達(dá)顯著上調(diào)，牙髓炎術(shù)后3d，SIRT1表達(dá)最高，隨后表達(dá)逐漸降低，與對(duì)照組相比差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：延髓背角內(nèi) SIRT1與神經(jīng)元標(biāo)記物NSE共存，與細(xì)胞核標(biāo)記物DAPI少量共存，提示SIRT1分子

10、主要表達(dá)在神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)。
　　3．體內(nèi)慢病毒感染過表達(dá)miR-34a后：慢性牙髓炎術(shù)后1d，大鼠疼痛程度明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組相比，miR-34a顯著增加3.25倍，SIRT1降低0.45倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小腦延髓池連續(xù)給予SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇后：SIRT1顯著增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；慢性牙髓炎術(shù)后1d疼痛程度降低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

11、P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1．牙髓暴露法操作簡(jiǎn)單，能有效的模擬臨床牙髓炎及其痛敏過程，可構(gòu)建理想的實(shí)驗(yàn)性牙髓炎痛敏模型；
　　2．在延髓背角，miR-34a和SIRT1主要表達(dá)于神經(jīng)元；慢性牙髓炎狀態(tài)下，miR-34a顯著降低、SIRT1顯著增加，且具有時(shí)間相關(guān)性，提示miR-34a、SIRT1分子與慢性牙髓炎疼痛關(guān)系密切；
　　3．SIRT1具有神經(jīng)保護(hù)作用，過表達(dá)SIRT1能發(fā)揮明顯的牙髓炎鎮(zhèn)痛作用；